银杏叶类脂的分离、制剂制备及生物活性研究

发布时间：2017-12-14 09:18

  本文关键词：银杏叶类脂的分离、制剂制备及生物活性研究

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【摘要】：银杏叶类脂(GL)是银杏叶(GBL)中重要的脂溶性生物活性物,其中的聚戊烯醇(PPs)与人体多萜醇结构相似,具有预防高血压、抗肿瘤、护肝,治疗老年痴呆等功效,目前尚未开发利用。因此,本文采用细胞破壁技术辅助提取GL,利用配位原理合成具有定向选择性的用于纯化GL的新型材料,以此获得高纯度PPs,并通过制备GL脂质体和凝胶剂来考察这两种药物制剂的生物活性,为新药开发以及功能性食品和化妆品的研制提供一定的理论指导。主要研究内容与结果如下:(1)破壁技术辅助提取GL的工艺优化对比酶法辅助超声和机械化学法两种细胞破壁技术提取GL的效果,并优化提取工艺。酶法辅助超声提取GL的最优工艺为:加酶量0.50 g(纤维素酶和果胶酶的质量比为1:2,酶活60 U/mg)、超声温度45℃、酶解pH为4.50,在此工艺条件下,PPs的含量可达0.80%。机械化学法提取GL最优工艺为:氢氧化钠浓度为30%,固液比1:15,提取温度80℃,提取时间4 h,在此最优工艺条件下,PPs的含量可达0.81%。这两种方法均能从根源上提高PPs的得率,但是考虑到机械化学法中产生的碱液不易处理,因此,选择酶法辅助超声作为GL的提取方法。(2)酶解液中水溶性成分的分离及功能特性酶解液中的水溶性成分主要由多糖和蛋白质组成。采用无水乙醇沉淀酶解液多糖,然后通过DEAE纤维素柱层析和G-100凝胶柱层析分离得到GBP11,GBP22和GBP33三种多糖单体,其分子量分别为1.94×103 kDa、5.17×103 kDa和46.0 kDa,并且这三种多糖均主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和鼠李糖组成,其摩尔比例分别为62.2:2.0:3.8:1.2、3.6:68.0:4.7:0.4和5.3:48.8:1.7:9.0。采用壳聚糖沉淀酶解液中蛋白质,然后通过活性炭脱色和透析技术纯化获得纯度为90.4%的蛋白质,该蛋白质具有较好的溶解度、持水持油性以及乳化性和乳化稳定性。(3)破壁辅助提取前后GBL的理化性质变化规律采用SEM、TG,HPLC和Py-GC-MS技术考察了破壁辅助提取前后GBL的理化性质变化规律,包括PPs含量、细胞壁外观形貌,裂解产物组成和热稳定性等。SEM试验结果表明,未经细胞破壁处理的GBL细胞壁表面光滑,并且细胞壁相邻孔洞之间排列紧密,而破壁辅助提取后GBL的细胞壁表面结构破坏严重,大量的孔洞出现,并且相邻孔洞之间排列疏松。TG试验结果表明,与未经破壁处理的GBL相比,破壁辅助提取后的GBL更易于进行热分解,热稳定性降低;此外,破壁提取前后GBL的热分解机理均为随机成核和随后生长反应控制机制,符合Avrami-Erofeev方程。HPLC试验结果表明,经破壁辅助提取后的GBL中几乎未检测出PPs的存在。Py-GC-MS试验结果表明,破壁辅助提取后GBL中12个碳以下的小分子化合物主要由水溶性成分组成,其总GC含量在破壁辅助提取后显著减少;12~20个碳的化合物主要为低极性物质,破壁辅助提取后其总GC含量的变化根据破壁辅助辅助提取技术的不同而不同。(4)GL纯化材料的合成及表征合成和表征了巯基/离子液体改性纳米二氧化硅固载银离子新型材料,并利用新型材料对GL进行了分离纯化,考察了分离纯化过程中的吸附动力学,吸附等温线和吸附机理。IR试验结果表明,新型材料中未出现羟基特征吸收峰,说明巯基和离子液体已经成功枝接到纳米二氧化硅上。SEM试验结果表明,与纳米二氧化硅相比,新型材料的团聚现象明显减弱,且颗粒度之间的分散性更好。XRD试验结果表明,化学改性对纳米二氧化硅的结构有一定的影响,但影响较小。吸附动力学试验结果表明,新型材料对GL的吸附在7 min左右基本上达到吸附平衡,其吸附量为83.4 mg/g,吸附符合二级动力学。以新型材料为固定床对GL进行分离,PPs的含量由43.9%上升到80.8%。吸附热力学试验结果表明,新型材料对GL的吸附是放热反应,低温有利于增加吸附量。此外,新型材料对PPs标准品的吸附要明显好于对GL的吸附。(5)GL的热解特性及机理研究对GL和PPs标准品在热解过程中的热稳定性、化学键断裂情况,热解动力学和热解机理进行了研究。试验结果表明,GL较稳定,268.3℃之后才开始剧烈分解,且随着反应的进行,甲基、亚甲基、游离的醇或酚、芳香族化合物,烯烃和酯的含量不断增加,但是由于GL热解不规律,因此无法对其热解动力学和热解机理进行分析;PPs标准品很稳定,在347.4℃之前,其质量损失不大,347.4℃之后才开始剧烈分解,并且随着热反应的进行,甲基、CO2、不饱和碳氢键、烯基、累积碳碳双键,碳碳双键和羟基的含量不断增加。此外,PPs的热解过程属于一级化学反应,其热解动力学表达式为:dα/dT=2.231×1013e(-20712/T)(1-α)/β。(6)GL纳米银制剂的制备及表征采用薄膜分散法制备了GL脂质体和PPs脂质体,确定了制备GL脂质体的最优的工艺条件为:卵磷脂∶胆固醇(m/m)=3:1,空白脂质体:GL溶液(m/v)=10:1,超声时间30 min;PPs脂质体的最优的工艺条件为:卵磷脂∶胆固醇(m/m)=3:1,PPs脂质体:PPs溶液(m/v)=5:1,超声时间30 min。并且,在此基础上制备了纳米银GL脂质体、纳米银PPs脂质体,纳米银GL凝胶剂和纳米银PPs凝胶剂,其平均粒径分别为397 nm、1114 nm、3223 nm和5940 nm。制备的纳米银脂质体和凝胶剂的物理稳定性均良好,且贮藏稳定性均高于其相对应的溶液的稳定性。此外,纳米银GL脂质体和纳米银PPs脂质体还具有较好的缓释作用。(7)GL及其制剂的生物活性研究考察了GL不同极性部位的抗氧化能力,以及制备的纳米银脂质体和凝胶剂的抑菌活性。抗氧化试验结果表明,浓缩物C对DPPH具有较强的清除能力,集分3对ABTS和羟自由基显示出较强的清除活性,PPs标准品对超氧阴离子具有较强的清除能力。抑菌活性试验结果表明,制备的四种纳米银脂质体和凝胶剂均对四种菌具有一定的抑制效果,其中,对大肠杆菌的抑制效果最好,其次分别是金黄色葡萄球菌,肺炎链球菌和白色念珠菌。纳米银GL凝胶剂对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌,白色念珠菌和肺炎链球菌抑菌效果最好,其抑菌圈范围为12.0~21.4 mm,MBC和MIC值范围依次为0.5~64μg/mL和16~256μg/mL。此外,纳米银GL脂质体和凝胶剂的抑菌活性强于纳米银PPs脂质体和凝胶剂,这可能与GL中非PPs成分与PPs协同抑菌作用有关。
【学位授予单位】：中国林业科学研究院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TQ464

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本文编号：1287355