蛋白质富集与活性分析的质谱新方法研究

发布时间：2017-12-23 10:13

  本文关键词：蛋白质富集与活性分析的质谱新方法研究　出处：《南京大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：蛋白质是生命体系的功能执行者,其活性与其自身状态密切相关。其中,翻译后修饰作为蛋白质活性最为普遍的调控方式,在生命体中广泛存在,并保证物质运输、遗传物质复制、细胞增殖、分化和凋亡等各项生命活动的正常进行。因此,系统性地探索蛋白质翻译后修饰过程并分析其活性,有助于进一步了解蛋白质的结构和功能,对于揭示疾病与蛋白活性的关系,开发临床诊断和治疗方法等具有重要意义。本论文以质谱平台为基础,结合纳米、编码、微阵列以及质谱成像等技术,合成了一种新型功能化材料,用于糖基化多肽的快捷分离和选择性富集;利用多肽编码技术构建质谱芯片,发展了一系列用于多种酶活性检测的方法。论文主要包括以下五个部分:1.糖基化多肽的浮力分离和选择性富集制得巯基苯硼酸修饰的金纳米粒子@二氧化硅浮球(MPB-Au@SiBs),并将其用于糖肽的浮力分离和选择性富集。MPB-Au@SiBs的合成采取分步法,条件温和,步骤简单,相比其它材料,浮力分离过程方便快捷。基于糖肽上顺式羟基与硼酸基团可逆的共价结合,用该材料捕获糖肽,随后在酸性条件下释放并进行质谱检测。MPB-Au@SiBs具有较好的富集容量、富集灵敏度和选择性,它简化了糖肽从复杂样品中的分离步骤,为糖蛋白组学分析提供了新工具。2.微孔板多肽编码用于蛋白酶活性的MALDI-TOF MS定量分析设计出多肽编码微孔板,用于蛋白酶活性的MALDI-TOFMS分析。所设计的多肽编码由编码区域和供蛋白酶剪切的底物区域构成,在被目标蛋白酶剪切后,编码区域由微孔板释放;以序列差别一个氨基酸的多肽作为内标,建立了酶活性检测的质谱定量分析方法,并以胰蛋白酶(trypsin)和胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)作为模型验证了多种蛋白酶定量分析的可行性。该多肽编码微孔板具有良好的选择性,为多种蛋白酶的种类鉴定和活性分析提供了新手段。3.高分辨质谱法测定多酶活性为验证上一章中MALDI-MS的定量分析技术,将多肽编码策略用于多种蛋白酶活性的高分辨质谱(HRMS)分析。该方法具有更高的灵敏度,无需内标即实现了对蛋白酶活性的准确定量,在临床诊断中具有广阔的应用前景。4.含硒多肽同位素策略用于酶活性的高可信度质谱分析为简化复杂体系中酶反应产物的鉴定过程并获取具有较高可信度的分析数据,发展了含硒多肽-高分辨质谱方法(SePeps-HRMS),并用于酶活性研究。将硒代蛋氨酸(SeMet)引入多肽底物,并与生物样品孵育反应,相关底物和产物在质谱全扫描模式下即可根据硒元素特殊的同位素分布特征被迅速辨别,无需进行二级质谱分析。由于对每条多肽而言,其固有的同位素比例如同其独一无二的"签名",通过比较同位素峰面积比值的实验值与理论值即可排除微小质量差异的干扰,提高定量分析的可信度。以细胞外信号调节激酶1(ERK1)和尿纤溶蛋白激活因子(uPA)为模型对方法进行了可行性验证。该方法有望成为高通量酶活性分析的有力工具,并可扩展应用于多酶相互作用以及底物筛选的相关研究。5.Caspase酶活性的MALDI-MS成像分析及其应用为获得更为直观的高通量酶活性分析结果,发展了 MALDI-MS成像分析技术,实现了多种酶活性的便捷可视化检测。方案以磷脂分子修饰多肽底物,利用其两亲性的特征保证了它在疏水玻片表面的有序组装,通过构建模拟生物膜,增强了 MALDI芯片表面的生物相容性,以使待测酶更易接近其底物。同时这一设计增加了酶反应产物的分子量,可以避免基质与生物样品中杂质的十扰,改善了检测信噪比与质谱分辨能力。实验选择含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族(Caspase-1,-2,-3和-8)为模型,将相应多肽底物分别与磷脂骨架分子连接并组装于疏水玻片表面,制备出用于酶活性检测的阵列芯片。在目标酶的作用下,底物被剪切产生质量位移,各酶的活性通过酶切产物的质荷比进行颜色编码,实现了多种酶活性的可视化与高通量定量检测。这一方法可用于Caspase家族抑制剂的筛选和化疗过程中癌细胞内一系列Caspase酶活性变化的监测,为耐药性细胞鉴别及抗癌药物筛选提供了有力工具,并可方便地扩展应用于其它酶体系,为探究更多生命过程中酶的作用机制提供了新途径。
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：O629.73;O657.63

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