石墨烯基纳米复合材料的合成与抗菌性能研究

发布时间：2017-12-24 03:27

本文关键词：石墨烯基纳米复合材料的合成与抗菌性能研究　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：虽然当今已步入医疗技术高度发达、健康促进行业多元发展的时代,但是病原菌感染仍然是人类面临的重要健康威胁之一,每年导致数以百万计的感染患者出现。近年来,抗生素的不合理应用已引起严重的细菌耐药问题,日益增多的耐药菌致使抗生素疗效不断下降,尤其是“超级细菌”的出现更使临床治疗几乎陷入了无药可用的境地。此外,由于新药研发滞后同时缺乏理想的抗生素替代疗法,细菌耐药迫使抗生素用量持续攀升,然而抗生素的过量使用反过来又加速了细菌新的耐药机制的产生,同时也导致了严重的药物不良反应以及大范围的环境污染,这似乎陷入了一个恶性循环。当前细菌耐药已成为世界范围内迫需解决的公共卫生难题。鉴于细菌耐药对人类健康造成的严重威胁,而传统抗生素难以有效应对的困境,人类不得不重新审视未来抗感染治疗的发展方向,探索抗生素外新型、廉价、有效的抗菌物质或治疗方法显得尤为重要。近年来非抗生素类抗菌物质的研究也因此成为科学热点,其中纳米抗菌材料的研发则被认为是最有希望克服细菌耐药问题并有实际应用前景的策略。这主要得益于纳米抗菌材料独特的物理化学特性及其固有或通过功能化修饰获得的高效杀菌活性,而这些纳米特性正是常态结构物质所不具备的,为此很多学者甚至提出了“纳米抗生素”的概念。作为新兴纳米材料,氧化石墨烯(graphene oxide,GO)由于超高的表面体积比、优异的平面性、丰富的可修饰功能集团以及良好的生物相容性,成为了抗菌活性物质的理想载体。具备良好抗菌活性的银纳米粒子(AgNPs)是最早被负载到GO上的纳米材料之一,所合成的氧化石墨烯-银(GO-Ag)纳米抗菌复合材料由于组分间协同效应的产生,展现了优异的杀菌性能。近年来,众多类型的GO-Ag纳米抗菌复合材料也因此得到了广泛的研究与报道。综述文献发现,当前报道的各类GO-Ag在水中具备良好的稳定性,但鲜有研究关注其在生理溶液中的稳定性及其长效杀菌性能,而这些性能对其实际应用非常重要;此外,目前关于GO是否具有固有抗菌活性也还存在很大争议。因此,为解决/阐明以上科学问题,本文在研究GO自身抗菌活性的基础上,分别利用具有良好溶解性的大分子聚合物聚乙二醇(PEG)和聚乙烯亚胺(PEI)对GO进行功能化修饰,并进一步负载AgNPs,合成了两种石墨烯基纳米抗菌复合材料,并对它们进行了系统表征与功能评价。第一部分针对当前GO在固有抗菌活性上存在的争议,实验室自制了GO并进行了深度纯化及系统表征,通过杀菌评价及形态学表征对GO的固有杀菌活性进行验证。实验结果表明GO未展现出明显杀菌活性,TEM下经GO处理后的细菌形态与对照组相比未观察到明显变化;此外,与菌体作用后,GO出现了明显的聚集和相互堆叠,致使其片层增厚及边缘钝化,进而导致GO失去了物理切割作用,这可能是GO在生理溶液中不能发挥杀菌作用的重要原因。第二部分通过对GO进行PEG功能化修饰及AgNPs负载,制备了GO-PEG-Ag纳米复合材料。结合构效关系,对比分析了不同实验因素对纳米材料制备的影响,确定了先共价修饰PEG后进行AgNPs负载的功能化修饰顺序,筛选了AgNPs的合成前体并优化了反应条件,制定了简便易行的石墨烯基纳米抗菌复合材料合成方案。通过AFM、UV-vis吸收光谱、XRD、FTIR、TGA、Zeta电位及粒度分析、TEM/HRTEM及AAS等手段对纳米复合材料的形貌、结构、功能集团及组分含量等性质进行了系统表征与分析。结果证实本研究借助微波辅助,不需额外添加还原剂,在3 min内即可完成AgNPs在复合材料上的原位还原及负载,形成的AgNPs以高密度(~27 wt%)均匀地覆盖在整个纳米复合物表面,并具有粒径小(~7nm)、尺寸均一、晶体结构良好等优点。稳定性测试表明GO-PEG-Ag纳米复合材料在多种生理溶液中分别经静置1个月甚至10000 g离心5min处理后仍可维持良好的分散状态。通过时间动力学实验考查了杀菌效果与作用时间的变化关系,确定了GO-PEG-Ag达到稳定杀菌效果所需的适宜作用时间(2.5 h)。以GO-Ag纳米材料为对照,通过最低抑菌浓度(MIC)测试、即时/长效杀菌实验、细胞毒性分析等实验,系统考查并对比分析了GO-PEG-Ag纳米材料的杀菌能力及细胞毒性。结果表明GO-PEG-Ag对标准菌株及耐药菌株展现了同等高效的杀菌效果,5μg/ml材料浓度对包括耐药菌(含blaNDM-1和mcr-1)及标准菌在内的革兰氏阴性菌E.coli的杀菌率99.5%,10μg/ml材料浓度对革兰氏阳性菌标准S.aureus及耐甲氧西林的S.aureus(MRSA)的杀菌率95%。浓度高达50μg/ml的GO-PEG-Ag对HeLa细胞刺激24 h后,细胞存活率仍可保持在80%左右。同步对比结果证实,三元GO-PEG-Ag复合材料在杀菌能力及生物相容性上均要优于二元GO-Ag纳米复合材料,尤其是在长效杀菌性能上,GO-PEG-Ag兼备了高效性与稳定性,生理盐水中静置1周的时间内,其杀菌率未观察到明显下降,波动范围5%;相反,GO-Ag长效杀菌能力较差,同等条件下其杀菌率下降超过65%。阐明了纳米材料生理条件下稳定性与杀菌效能之间的正向促进关系。我们又通过TEM、荧光共聚焦显微镜及蛋白质泄露、活性氧(ROS)及ATP水平检测等手段进一步探究了GO-PEG-Ag纳米材料的杀菌机制。结果表明破坏细胞壁/膜结构、导致细胞质渗漏、诱导氧化应激损伤及影响细菌代谢功能可能是纳米复合材料主要的杀菌机制。第三部分通过引入阳离子聚合物支链PEI成功制备了GO-PEI-Ag纳米抗菌复合材料,并其进行了系统表征与功能评价。结果表明,GO-PEI-Ag纳米复合材料在性能上与GO-PEG-Ag相近,同样具备多种生理溶液中优异的稳定分散能力。此外由于带有更高的正电性,促使GO-PEI-Ag更容易捕获溶液中带负电性的细菌,致使其杀菌能力更优于GO-PEG-Ag。当作用浓度为10μg/ml时,GO-PEI-Ag对包括多种耐药菌在内的E.coli及A.baumannii的即时杀菌率均达到了~100%,对S.aureus标准菌株和MRSA的即时杀菌率也分别达到了99.1%和98.0%。长效杀菌能力测试结果显示,GO-PEI-Ag在生理盐水中存储1周后对E.coli及A.baumannii的杀菌率99%,对S.aureus标准菌株和MRSA的杀菌率96%。细胞毒性测试显示经50μg/ml的GO-PEI-Ag刺激24 h后,HeLa细胞存活率为~72%,表明GO-PEI-Ag同样具有较低的生物毒性。综上所述,本研究成功制备了两种可稳定分散于生理介质中的石墨烯基纳米抗菌复合材料。GO-PEG-Ag和GO-PEI-Ag具备高效杀菌性、良好生物相容性及长效性的优点,表明它们在生物医药和公共卫生领域具有良好的应用前景,并有希望成为抗生素外应对病原菌,尤其是耐药菌感染的替代治疗手段。同时也希望通过本文为相关纳米抗菌材料的研究制备提供理论与实践参考。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TB332

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