利用可溶性诱导物批式流加发酵培养里氏木霉生产纤维素酶

发布时间：2017-12-29 13:32

  本文关键词：利用可溶性诱导物批式流加发酵培养里氏木霉生产纤维素酶　出处：《大连理工大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

  更多相关文章： 木质纤维素类生物质 纤维素酶 里氏木霉 诱导物 β-葡萄糖苷酶 分 批补料策略

【摘要】：基于木质纤维素类生物质资源生产的生物燃料和生物基化学品具有可再生和环境友好的优点,对经济和社会可持续发展具有重要意义。这类生物质的生物炼制主要包括预处理、纤维素酶生产、纤维素组分酶解糖化和微生物发酵等单元操作及这些操作单元的系统集成和优化,而纤维素酶成本高是制约生物炼制产业化技术开发的瓶颈之一。里氏木霉(Trichoderma reesei)是纤维素酶高产菌株,但该菌株纤维素酶合成需要诱导。纤维素是T.reesei纤维素酶合成的天然诱导物,以微晶纤维素最有效,尽管其价格昂贵。然而,纤维素是不溶性的,需要依靠菌株低水平本底纤维素酶缓慢水解释放出真正诱导物才能诱导纤维素酶大量合成,这一过程显著延长了纤维素酶发酵时间,相应降低了发酵罐纤维素酶生产强度。由于T.reesei液体深层发酵生产纤维素酶为高粘度非牛顿型流体且强好氧过程,生产强度低导致纤维素酶发酵过程搅拌和通风的能耗成本极高。使用预处理后的秸秆、蔗渣及纸浆等廉价纤维质原料作为诱导物,虽然可以解决微晶纤维素等成本高的问题,但菌株本底纤维素酶水解这类纤维质原料的效率极低,导致诱导产纤维素酶效果非常差,纤维素酶发酵生产的能耗成本更高。可溶性诱导物可以被菌株直接利用,预期可以有效解决纤维素类诱导物存在的突出问题,然而目前开发的乳糖等可溶诱导物不仅成本较高,而且纤维素酶诱导效果差。本研究合成了低成本高效可溶诱导物,在此基础上以T.reeseiRut C30为模式菌株,对纤维素酶的发酵生产、纤维素酶系改造优化以及原位生产的粗酶水解预处理后秸秆等过程进行了研究。以葡萄糖为底物,利用β-葡萄糖苷酶催化的转糖苷反应,制备含(β)二糖的可溶诱导物。转糖苷反应特点使反应结束时残留大量葡萄糖,这种葡萄糖和(β)二糖混合物(MGD),可以更好促进菌丝生长,同时高效诱导纤维素酶合成。此外,还选择并研究了 β-1,3-葡聚糖对T.reesei生长和纤维素酶合成的诱导效果。摇瓶实验结果表明MGD和β-1,3-葡聚糖更容易被菌体利用,诱导纤维素酶合成能力分别是乳糖的1.16倍和1.24倍,纤维素酶关键组分基因表达分析进一步验证了这些实验结果。虽然MGD和β-1,3-葡聚糖诱导里氏木酶产纤维素酶效果相近,但是MGD成本较低。利用离子色谱分析了MGD的组成,发现二糖类诱导物主要为龙胆二糖、纤维二糖和槐糖,其中槐糖起最主要诱导作用。比较了酸水解甜菊糖苷制备槐糖和β-葡萄糖苷酶催化转化葡萄糖制备MGD,与酸水解甜菊糖苷相比,β-葡萄糖苷酶催化转化葡萄糖制备MGD在成本以及过程重复性上都有优势,而且无论是使用商业β-葡萄糖苷酶还是自制β-葡萄糖苷酶,其催化转化高浓度葡萄糖生成的MGD,均能高效诱导里氏木霉生产纤维素酶。以MGD为诱导物,在7 L发酵罐中进行液体深层培养T.reesT.Rut C30生产纤维素酶。为避免MGD中高浓度葡萄糖对里氏木霉合成纤维素酶的抑制,开发了基于控制发酵液中葡萄糖浓度流加MGD进行补料的策略,葡萄糖浓度控制为0.05-0.30 g/L。实验结果表明,发酵时间144 h时,纤维素酶活达到90.4 FPU/mL,比报道的乳糖诱导纤维素酶酶活水平高10倍以上,纤维素酶生产强度高达627.1 FPU/L/h,是目前报道T.reesei生产纤维素酶生产强度的3-5倍。为了评价MGD诱导的纤维素酶(Cel-MGD),测定两种纤维素酶的比酶活并利用分泌蛋白组学分析对比了 Cel-MGD与碱预处理后玉米秸秆(APCS)作为诱导物生产纤维素酶(Cel-APCS)的蛋白组成,结果表明Cel-MGD诱导的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶比酶活分别提高1.74倍和2.42倍,但Cel-MGD中仍严重缺乏β-葡萄糖苷酶,而Cel-APCS含有更高的木聚糖酶活和纤维素降解辅助蛋白。为了弥补Cel-MGD中严重缺乏β-葡萄糖苷酶的缺陷,构建了组成型强启动子Ppdcl高效过表达外源β-葡萄糖苷酶基因aabgll的表达载体,并利用农杆菌介导的遗传转化方法将其导入T..reeseiRutC30,转化子生产β-葡萄糖苷酶的能力普遍提高。利用产葡萄糖苷酶最高的重组菌T.reesei PB3分批补料发酵生产纤维素酶,156 h纤维酶活超过50 FPU/mL,β-葡萄糖苷酶酶活超过310 CBU/mL,比宿主菌β-葡萄糖苷酶酶活提高约70倍。该重组酶命名为Cel-MGD2,其与补加商品β-葡萄糖苷酶的Cel-MGD水解15%(w/v)APCS性能无显著差别,葡萄糖收率均超过92%,发酵过程乙醇浓度超过44.0 g/L。提高APCS的浓度到20%(w/v),利用Cel-MGD2进行分步糖化发酵(SHF)和同步糖化发酵(SSF)生产乙醇,在SHF工艺条件下发酵120h,终点乙醇浓度达到54.2 g/L,而SSF条件下发酵96h,终点乙醇浓度为52.1g/L。虽然SSF过程产乙醇浓度略低,但乙醇生产强度显著提高。这些结果表明改造后的重组酶不需要复配就可以用于预处理后秸秆类生物质水解。为实现纤维素和半纤维素的综合利用,在T.reesei Rut C30过表达同源外切纤维素酶基因cbh2构建纤维素酶高产菌株,并以MGD和APCS混合诱导物提高纤维素酶中木聚糖酶活性,生产可高效水解含有高浓度半纤维素原料的纤维素降解酶。优化MGD和APCS比例后,通过分批补料,发酵60h时纤维素酶活达到7.17FPU/mL,木聚糖酶活性达到577.55 IU/mL,该粗酶液比MGD或APCS单独诱导的纤维素酶降解APCS的效果更好,而且粗酶液不需要进行任何处理即直接进行预处理后的秸秆水解,粗酶液提高温度至50℃,批次加入APCS至20%,最终测定释放122.5 g/L葡萄糖和40.21 g/L木糖,产糖效果高于已有报道。研究工作进展对高效生产纤维素酶,特别是原位产酶应用于木质纤维素类生物质生物炼制,具有重要意义。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TQ925

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 乞永立,耿月霞,任章启;纤维素酶的生产及应用[J];河北化工;2000年01期

2 杨叶东,韩yN君,张金龙;纤维素酶的研究、生产及其在纺织上的应用[J];激光生物学报;2000年02期

3 汪测生;纤维素酶[J];山东纺织科技;2000年04期

4 汪多仁;纤维素酶在纺织工业中的应用[J];四川化工与腐蚀控制;2000年05期

5 孟雷,陈冠军,王怡,高培基;纤维素酶的多型性[J];纤维素科学与技术;2002年02期

6 张威;新一代的纤维素酶[J];国外纺织技术;2004年06期

7 刘桂荣,张鑫,郑明珠;纤维素酶的生产及应用前景[J];食品研究与开发;2004年01期

8 韩韫,蔡俊鹏;产纤维素酶海洋菌株的筛选及鉴定[J];现代食品科技;2005年03期

9 王菁莎,王颉,刘景彬;纤维素酶的应用现状[J];中国食品添加剂;2005年05期

10 赵荣乐;;纤维素酶研究进展[J];喀什师范学院学报;2005年06期

相关会议论文 前10条

1 吕东海;周岩民;李如治;;饲用纤维素酶及其应用研究进展[A];酶制剂在饲料工业中的应用[C];2005年

2 陈清华;冯钦龙;周辉;;纤维素酶生产的研究进展[A];酶制剂在饲料工业中的应用[C];2005年

3 杨家华;郭志宏;;纤维素酶在反刍动物生产上的应用[A];中国奶牛协会2007年会论文集（上册）[C];2007年

4 曾涛;曾会才;陈汉清;;海南省部分纤维素酶高产菌株的分离与鉴定[A];2009年海南省微生物学检测及质量保证研讨会论文集[C];2009年

5 王凤超;陈冠军;刘巍峰;;环境基因组文库的构建及纤维素酶基因的筛选[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年

6 王娟;李欣;吴松刚;黄建忠;;长梗木霉外切纤维素酶基因的克隆及其表达[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2009年学术交流会论文摘要汇编[C];2009年

7 王骥;丁明;李燕红;陈清西;许根俊;赵辅昆;;动物内源性纤维素酶:福寿螺(Ampullaria crossean)多功能纤维素酶基因的克隆[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2003年学术交流会论文摘要集[C];2003年

8 冯文英;;固体纤维素酶的浸渍条件优化及其特性研究[A];中国造纸学报2003年增刊——中国造纸学会第十一届学术年会论文集[C];2003年

9 赵辅昆;王骥;陈清西;许根俊;;纤维素酶的研究进展[A];第七届全国酶学学术讨论会论文摘要集[C];2004年

10 姚强;黄琰;陈冠军;;产耐碱性纤维素酶丝状真菌的筛选及研究[A];山东微生物学会第六次会员代表大会暨2004年学术年会论文集（上）[C];2004年

相关重要报纸文章 前10条

1 平远 译;纤维素酶可提高秸秆饲料利用率[N];福建科技报;2004年

2 河北农业大学动物科技学院 孙洪新邋甄二英;纤维素酶在动物营养中的应用[N];中国畜牧兽医报;2008年

3 王菁莎　王颉 刘景彬;纤维素酶的应用现状[N];中国食品质量报;2009年

4 刘国信;开发纤维素酶制剂大有可为[N];经理日报;2004年

5 陆慕寒 整理;35项印染行业节能减排先进技术——助剂篇(二)[N];中国纺织报;2008年

6 山东农业大学 王纪亭;饲料原料资源匮乏出路何在[N];中国畜牧报;2003年

7 ;2009年印染行业节能减排优秀技术创新成果推介[N];中国纺织报;2009年

8 冯卫东;科技将这样改变我们的生活[N];科技日报;2008年

9 ;高活力纤维素酶生产技术　[N];中国化工报;2002年

10 本报记者 李晓岩;生物炼制：突破纤维素利用瓶颈[N];中国化工报;2007年

相关博士学位论文 前10条

1 张庆;瑞氏木霉纤维素酶降解模式及其功能多样性研究[D];山东大学;2015年

2 张聪;Cytophaga hutchinsoni纤维素酶系研究[D];山东大学;2015年

3 韩超;嗜热真菌新的热稳定纤维素酶的克隆、表达和功能研究[D];山东农业大学;2015年

4 吕新星;里氏木霉纤维素酶基因转录调控因子Xyr1功能研究及铜离子响应高效表达体系的建立[D];山东大学;2015年

5 郭红;高固体系纤维素酶水解与回收强化研究[D];天津大学;2015年

6 刘奎美;纤维素酶转录调控因子及纤维素酶应用的研究[D];山东大学;2016年

7 韩小龙;纤维素酶补料发酵工艺及木糖渣生产葡萄糖酸钠的研究[D];山东大学;2017年

8 王美美;耐碱性纤维素酶的表达及其对纸浆改性和机制研究[D];山东大学;2017年

9 李勇昊;利用可溶性诱导物批式流加发酵培养里氏木霉生产纤维素酶[D];大连理工大学;2017年

10 张飞;利用人工锌指蛋白技术提高里氏木霉Rut-C30纤维素酶产量[D];大连理工大学;2017年

相关硕士学位论文 前10条

1 耿月姗;纤维素酶在几种咪唑类离子液体中活性研究[D];天津大学;2009年

2 钱文佳;南极细菌产低温纤维素酶的研究[D];哈尔滨工业大学;2009年

3 舒勤;嗜碱性芽孢杆菌Bacillus sp.AC-2产纤维素酶的研究[D];浙江大学;2004年

4 赵燕;高效纤维素酶高产菌的筛选及相关研究[D];武汉科技大学;2013年

5 李娜;耐热真菌纤维素酶基因的克隆与序列分析[D];山东农业大学;2013年

6 田海娇;纤维素酶生产菌的筛选、诱变及产酶机制的初步研究[D];东北林业大学;2015年

7 訾晓雪;不同底物诱导下桦剥管菌纤维素酶活和蛋白质组学研究[D];东北林业大学;2015年

8 谭玲;高效水解甘油有机溶剂预处理麦草纤维素酶制剂的选择和复配[D];江南大学;2015年

9 李靖一;pGAP调控下的内切纤维素酶组成型表达及酶制剂的制备[D];河北农业大学;2015年

10 王帅;纤维素酶活性架构及TrCel12A关键亚位点氨基酸功能研究[D];山东大学;2015年

，

本文编号：1350477