精氨酸酶的高效表达、性质及其产L-鸟氨酸的应用研究

发布时间：2018-01-20 04:11

本文关键词： L-鸟氨酸精氨酸酶生物转化枯草芽孢杆菌食品级　出处：《江南大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：L-鸟氨酸是尿素循环中的重要中间代谢产物,在人体中是一种非必需氨基酸。L-鸟氨酸因具有保肝护肝、减肥保健、抗疲劳、促进伤口愈合和抑制苦味等多种生理功能而被广泛应用于食品、化工、医药等领域。精氨酸酶可以水解L-精氨酸生成L-鸟氨酸及尿素。相比于其他L-鸟氨酸生产方法,酶法生产具有催化效率高、反应副产物少、专一性强等优点。目前工业化生产L-鸟氨酸的精氨酸酶多取自于动物肝脏,而微生物来源的精氨酸酶丰富且成本较低,开发微生物精氨酸酶资源具有很大的应用潜力。酶法生产以成本相对较高的L-精氨酸为底物,需要进一步提高底物转化效率来降低成本。基因工程菌的抗生素耐药性已是全球性问题,选用安全宿主和构建无抗生素抗性基因的工程菌株是未来精氨酸酶工程菌株的发展方向。本研究通过菌株的筛选,得到了一株精氨酸酶高产菌株Rummeliibacillus pycnus SK31.001,并以此菌株为出发菌株分离纯化出了精氨酸酶蛋白;利用PCR技术推导出精氨酸酶的编码基因序列,成功将该基因在大肠杆菌中克隆表达;对精氨酸酶的酶学性质进行研究,构建了精氨酸酶与脲酶的双酶反应体系;实现了精氨酸酶在枯草芽孢杆菌中的多拷贝、无抗生素抗性基因的整合表达,为L-鸟氨酸的食品级生产奠定了应用基础。主要研究内容和结果如下:(1)在菌株筛选中,添加L-精氨酸以诱导精氨酸酶合成,利用HPLC对L-鸟氨酸进行鉴定并分析发酵菌体转化L-精氨酸的能力,选取了R.pycnus SK31.001为初始菌株。利用正丙醇沉淀、DEAE-Sepharose FF弱阴离子交换色谱和Superdex 200凝胶层析对精氨酸酶进行分离纯化,得到了电泳纯的酶液,比酶活为256.2 U/mg。SDS-PAGE和凝胶排阻色谱分析纯化的精氨酸酶蛋白质,亚基分子量为34 k Da,蛋白分子量为196 k Da,证明来自于R.pycnus的精氨酸酶为六聚体结构。根据不同来源的精氨酸酶氨基酸序列的保守区域设计简并引物,利用简并PCR扩增出R.pycnus精氨酸酶基因的部分序列,长度达717 bp。根据已知的部分序列设计反向引物,利用反向PCR技术扩增已知序列的翼侧未知部分,将得到的序列与已知序列进行拼接,推导出R.pycnus精氨酸酶基因的ORF框,共906 bp。提交至NCBI,获得登录号为:KP702726。对比不同来源的精氨酸酶氨基酸序列,发现R.pycnus精氨酸酶活性中心氨基酸残基严格保守,Asp123,His125,Asp228,Asp230,His100和Asp127与中心双离子相连,证明了所调取的基因编码一种精氨酸酶。(2)将PCR扩增获得的R.pycnus精氨酸酶基因插入p ET-28a(+)表达载体,构建重组质粒并转化入宿主菌株,获得重组菌株E.coli BL21(DE3)/p ET-28a(+)-arg。利用Ni~(2+)Sepharose 6 FF亲和色谱柱成功纯化出重组R.pycnus精氨酸酶,其亚基分子量约为34k Da,与野生菌纯化结果相当。利用HPLC对酶反应产物进行分析,发现反应产物为L-鸟氨酸,确认克隆表达的基因序列为精氨酸酶序列。Mn~(2+)可以显著增强R.pycnus精氨酸酶活力,当Mn~(2+)浓度达2 mmol/L时,精氨酸酶获得最大酶活。R.pycnus精氨酸酶的最适反应p H为9.5,在p H 8.0-10.0间相对酶活较高且在p H 8.0-9.0条件下相对稳定。最适反应温度为80°C,在50°C下具有良好的热稳定性。在最适条件下比酶活达914U/mg,K_m、V_(max)、k_(cat)和k_(cat)/K_m值分别为0.212 mmol/L、1111 U/mg、629.6 s~(-1)及2910mmol/L/s。利用R.pycnus精氨酸酶进行生物转化反应生产L-鸟氨酸,在200 g/L的底物浓度下,反应6 h,转化率可达到95.2%。研究发现,R.pycnus精氨酸酶可被Ni~(2+)激活。为进一步提高底物转化率,除去反应中生成的副产物尿素,构建了R.pycnus精氨酸酶和刀豆脲酶的双酶反应体系。在添加Ni~(2+)的条件下,精氨酸酶与脲酶均在p H 6.5和40-50°C间有着较高酶活,在p H 6.0-8.0和40-50°C条件下具有较好的稳定性。双酶转化L-精氨酸,反应反应3 h,转化率可达到99.7%且无尿素残留。(3)利用重叠延伸PCR技术,将枯草芽孢杆菌中的P43启动子与R.pycnus精氨酸酶基因融合以增强精氨酸酶的表达。利用定点整合与随机整合表达的方法将表达单元P43-arg与lox71-spc-lox66抗性基因表达盒分别插入arg I基因被敲除的枯草芽孢杆菌BSKA染色体的amy E、thr C位点和未知的位点中,成功构建了2、2、2、3拷贝数的重组菌株。利用原生质转化技术,对重组菌株进行染色体重排,利用Cre/lox重组系统将染色体上的抗生素抗性基因敲除,最终成功构建了9拷贝数的重组菌株BSKA-C3,发酵酶活可达14.5 U/m L。利用全细胞转化L-精氨酸生成L-鸟氨酸,转化8 h,L-鸟氨酸浓度达到145.8 g/L,摩尔转化率达96.1%。考察重组菌株的整合稳定性,传代10次发酵酶活没有下降,说明重组菌株BSKA-C3具有良好的整合稳定性。
[Abstract]:L - ornithine is an important intermediate metabolite in urea cycle , it is a non - essential amino acid in human body . A total of 906 bp was obtained . The accession number of the amino acid residues from different sources was obtained by the submission of the amino acid sequence from different sources . Asp123 , His125 , Asp228 , Asp230 , His100 and Asp127 were linked to the double - ion of the center . coli BL21 ( DE3 ) / p - ET - 28a ( + ) - arginine was successfully purified by using Ni ~ ( 2 + ) Sepharose 6 FF affinity chromatography column . The recombinant strain BSKA - C3 was successfully constructed by using protoplast transformation technique .

【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TQ922

【参考文献】