D-甘露糖异构酶产生菌的筛

发布时间：2018-03-21 09:42

本文选题：D-甘露糖异构酶　切入点：D-甘露糖　出处：《江南大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：D-甘露糖是一种常见的食品营养补充剂,具有调节血糖反应和促进肠道健康等作用,也是部分免疫刺激剂、维生素、甘露醇等生物制剂的起始合成材料。游离D-甘露糖在自然界中存在较少,直接提取法受到原料和季节的限制,而化学合成法因副产物多民众接受度低。因此,生物酶法合成D-甘露糖成为新的发展趋势,本研究主要目的是获得D-甘露糖异构酶高产菌株,用于大规模生产制备D-甘露糖。从腐烂水果中分离、筛选出一株D-甘露糖异构酶产生菌Pseudomonas sp.SK27.016,保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC),编号为CCTCC NO:M2014411。利用HPLC、LC-MS、1H NMR和FT-IR进行产物鉴定,确定该菌全细胞催化D-果糖的主要产物为D-甘露糖。收集Pseudomonas sp.SK27.016菌体超声破碎上清作为粗酶液,经硫酸铵分级沉淀、Hi Trap Q HP阴离子交换柱层析、Hi Trap Phenyl FF[HS]疏水柱层析等步骤,获得的D-甘露糖异构酶经SDS-PAGE电泳分析显示为单一条带。通过酶学性质研究,该酶的最适温度为40°C,最适p H 8.0;纯酶在4°C储存6个月可以保持90%以上的酶活;同时该酶也是非金属依赖酶,Zn2+、Ni2+和Cu2+能强烈抑制酶活。在最适条件下,D-果糖和D-甘露糖的平衡比率约为75:25,催化D-果糖的动力学参数Km为224.27 m M,kcat为21.67 s 1,催化效率(kcat/Km)为96.63 s 1 M 1。为获得更好的产酶菌株,选定来源于大肠杆菌的D-甘露糖异构酶基因yih S进行同源克隆表达,构建了两个工程菌:E.coli BL21/p ET20b(+)-yih S和E.coli BL21/p ET28a(+)-yih S。两个工程菌均表达活性D-甘露糖异构酶,但p ET28a(+)更适合yih S的表达,产生出大量可溶性胞内酶蛋白。E.coli BL21/p ET28a(+)-yih S在28°C条件下加入1 m M IPTG诱导6 h酶表达量最高,胞内发酵酶活约为4.8 U/m L。将大肠杆菌的D-甘露糖异构酶基因yih S利用B.subtilis进行表达,成功构建菌株B.subtilis 168/p MA5-yih S和B.subtilis WB800/p MA5-yih S。在Hpa II启动子作用下,该重组菌株无需诱导即可产生MIase酶;优化发酵条件后,将重组菌在小型发酵罐(3.0 L)内采用补料分批发酵策略,39 h时发酵上清酶活高达51.2 U/m L,是大肠杆菌表达系统的10.7倍左右。将发酵得到的1.3 L酶液过滤分离收集上清,获得MIase粗酶液,超滤浓缩至五分之一体积后冻干,可制成6.7 g淡灰色粗酶粉。在1 g/L粗酶粉作用下,150 g/L的D-甘露糖可由600 g/L的底物D-果糖转化两小时获得,转化率约为25%,时空产率(Space time yield,STY)约为75 g D-甘露糖/L/h。通过DEAE离子交换柱层析对B.subtilis WB800/p MA5-yih S表达的MIase酶进行分离纯化,其亚基分子量约为45 k Da,酶蛋白分子量为275 k Da。重组D-甘露糖异构酶催化D-果糖的最适温度为45°C,最适p H为7.0,酶学性质与Pseudomonas sp.SK27.016MIase相比,最适温度提高了5°C,p H偏向中性;Co2+、Ni2+和Zn2+对酶活有明显抑制作用,而Cu2+可使酶完全失活;该重组酶催化D-果糖的动力学参数Km为203.7±6.7 m M,Vmax为0.6μM s 1 mg 1,kcat为27.7±0.7 s 1,催化效率(kcat/Km)为136.0±2.9 s 1 M 1,和Pseudomonas sp.SK27.016相比催化效率有所提高。利用B.subtilis 168来源的组成型强启动子P43与yih S基因通过重叠延伸PCR技术融合,通过双交换整合将P43-yih S表达框和lox71-Spc-lox66基因框整合至B.subtilis1A751染色体上的淀粉酶基因位点,然后利用Cre/lox P系统敲除抗性基因,成功构建食品级重组菌株B.subtilis 1A751/lox-P43-yih S,在启动子P43的作用下,E.coli来源的MIase酶基因yih S在对数期及稳定期均可表达,发酵14 h OD600值约为5.6,发酵16 h酶活约为3.5 U/m L,较重组菌B.subtilis WB800/p MA5-yih S要低,但表达稳定性较好。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TQ929;TS218

【参考文献】