亮氨酸应答调控因子Lrp调控抗生素生物合成的分子机制及应用

发布时间：2018-04-15 12:02

本文选题：亮氨酸应答调控因子(Lrp家族) + 糖多孢红霉菌　；参考：《安徽大学》2017年博士论文

【摘要】：Lrp(Leucine-responsive regulatory protein)家族,又被称为 Lrp/AsnC 家族,是一类广泛存在于原核生物中的转录调控因子,能够参与调控细胞的多个生理过程,包括氨基酸的代谢、胞内外物质的转运、DNA的修饰与重组、细菌抗性等多个方面。然而目前在产抗生素的放线菌中关于Lrp蛋白调控抗生素生物合成的研究非常少,具体的调控机制更是有待深入的探究。红霉素(Erythromycin)是一种大环内酯类抗生素,由放线菌(Actinomycete)中糖多孢红霉菌(Saccharopolyspora erythraea)次生代谢产生,对于多种致病菌都具有较强大的抗菌活性。根据生物信息学分析,糖多孢红霉菌中SACE_Lrp(SACE_5388)基因编码一种Lrp家族的同源蛋白,与已报道的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)中Lrp同源性高达56%,并且它们转录方向相反的邻近基因都是编码分支氨基酸ABC转运蛋白。本研究首先利用大肠杆菌体外表达技术得到可溶性的SACE_Lrp蛋白,通过蛋白与DNA结合的EMSA实验证实了 SACE_Lrp对邻近的4CE_5387-5386具有直接的调控作用。为了探究SACE_Lrp在糖多孢红霉菌中的功能,我们通过大片段敲除技术在糖多孢红霉菌A226中构建了SACE_Lrp缺失突变株。高效液相色谱分析表明,与出发菌株A226相比,SACE_Lrp缺失突变株(△SACE_Lrp)中红霉素产量提高了 25%,而SACE_Lrp基因回补后,红霉素的产量回复到出发菌株的水平,同时在A226中对SACE_Lrp过表达后红霉素产量相比出发菌株下降23%,说明SACE_Lrp对红霉素生物合成具有负调控作用。SACE_Lrp的缺失对糖多孢红霉菌的菌体生长和形态分化并无明显的影响。进一步的qRT-PCR分析显示,SACE_Lrp缺失突变株中红霉素生物合成基因簇中基因eryAI和ermE、邻近的分支氨基酸ABC转运蛋白基因SACE_5387-5386以及分支氨基酸代谢路径中氨基转移酶基因ilvE的转录水平都有显著升高,表明SACE_Lrp很可能通过调节红霉素结构基因、邻近分支氨基酸转运基因以及分支氨基酸代谢基因转录水平最终影响红霉素的产生。利用氨基酸自动分析仪对A226与△SACE_Lrp的胞内外游离氨基酸分析结果表明,△SACE_Lrp中胞外三种分支氨基酸(Val、Ile和Leu)的含量低于A226,而△SACE_Lrp胞内三种分支氨基酸的含量也低于A226,说明SACE_Lrp的缺失不仅影响分支氨基酸从胞外转运至胞内,还影响了胞内分支氨基酸的代谢转化,从而影响红霉素生物合成的前体供应。我们在糖多孢红霉菌A226中过量表达SACE5387-5386,红霉素产量提高了 31%。进一步在糖多孢红霉菌A226的发酵培养基中分别添加分支氨基酸后,红霉素的产量相应提高 47%(Val)、35%(Ile)和 16%(Leu)。本研究利用DNase I footprinting技术解析了糖多孢红霉菌中SACE_Lrp的保守结合位点为一段富含GC的DNA序列:CCTCCGGGCAACATTC,并通过缺失突变进行了验证。根据保守结合位点的分布位置,推测SACE_Lrp不仅调控邻近的转录方向相反的S4CE_5387-5386,还可能具有自我调控的作用,本研究通过设计体内的GFP报告系统证实,SACE_Lrp对自身的转录存在转录抑制。Lrp家族的一大特征是C末端结构域具有响应配体氨基酸的能力,通过在体外EMSA体系中添加20种蛋白质氨基酸,发现添加Lys和Arg可以抑制SACE_Lrp与靶DNA的结合,而添加His可以促进蛋白与靶DNA的结合,说明SACE_Lrp具有双向响应的氨基酸配体,Lys和Arg是抑制型配体,His是促进型配体。进一步通过设计体内GFP报告系统,证实了 SACE_Lrp在体内情况下同样可以对三种配体氨基酸进行应答。目前为止,糖多孢红霉菌SACE_Lrp是Lrp家族蛋白中首次被解析双向响应配体的成员。糖多孢红霉菌低产菌株A226中,SACE_Lrp的缺失、增加SACE_Lrp靶基因SACE_5387-5386的拷贝数,以及添加SACE_Lrp调控底物分支氨基酸三种策略在提高红霉素产量方面都取得了良好的效果。我们将这三种策略应用于红霉素工业高产菌株WB。高效液相色谱分析表明,WB中缺失SACE_Lrp基因(WB△SACE_Lrp)后,突变株红霉素产量提高19%;在缺失SACE_Lrp基因的基础上过量表达SACE_5387-5386(WB△SACE_Lrp/5387-5386),红霉素产量较出发菌株WB提高41%;在工业发酵培养中额外添加10 mM Val,WB△SACE_Lrp/5387-5386的红霉素产量较WB提高48%,最终在5-L发酵罐水平上,红霉素的产量由3503 mg/L显著提高41%,达到5001mg/L。说明在红霉素工业高产菌株中,以SACE_Lrp调控元件为基础的改造确实可以显著的提高红霉素的产量,这一调控元件的开发和应用为未来其他工业高产菌株的改造和筛选提供了基础。根据同源性分析比对,SACE_Lrp的同源蛋白广泛存在于其他产抗生素的放线菌中,为了研究Lrp蛋白对于抗生素生物合成的调控功能是否具有普适性,我们选择模式链霉菌-天蓝色链霉菌作为代表。通过在天蓝色链霉菌M145中缺失SACE_Lrp同源蛋白基因SCO3361,构建缺失突变株△SCO3361,并对次级代谢产物进行分析发现,SCO3361缺失突变后,放线紫红素(Act)的产量急剧下降至出发菌株的20%水平,而十一烷基灵菌红素(Red)和钙依赖抗生素(CDA)的产量并无显著变化。SCO3361缺失突变后,菌株的产孢能力也明显下降,说明SC03361不仅调控天蓝色链霉菌的次级代谢,还调控菌株的形态分化。这些结果说明在产抗生素的放线菌中,Lrp同源蛋白对于抗生物生物合成的调控作用是很可能普遍存在的。qRT-PCR分析结果显示,SC03361缺失突变株中Act生物合成基因簇的簇内调控蛋白基因actⅡ-ORF4(SC05085)和产孢相关蛋白基因amfC(SCO4184)、whiB(SCO3034)、ssgB(SCO1514)的转录水平明显下降,说明SC03361对Act的生物合成和菌株的孢子形成具有显著的正调控作用;△SC03361突变株中,自身基因表达量显著升高,证实SC03361同样具有抑制自身转录的调控作用。EMSA实验证实,SC03361能够结合actⅡ-ORF4的启动子,说明SC03361能够直接调控Act的生物合成基因簇。通过qRT-PCR分析结合EMSA实验发现SC03361也同样可以直接调控邻近的转录方向相反的SC03362。利用体外EMSA和体内GFP报告系统,解析Phe是SC03361的抑制型配体,Cys是SC03361的促进型配体。EMSA实验证实SACE_Lrp能够与SC03361的靶DNA结合,而SC03361也能够与SACE_Lrp的靶DNA结合,二者存在交叉调控的作用。我们的研究结果说明天蓝色链霉菌中Lrp同源蛋白SC03361不仅可以调控特定抗生素的生物合成,还调控了天蓝色链霉菌的形态分化,说明Lrp家族蛋白在其他产抗生素的放线菌中同样可以调控抗生素的生物合成,很可能具有普遍性的调控作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TQ927

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