Shewanella oneidensis MR-1降解偶氮染料的机理及偶氮还原酶活性位点的研究

发布时间：2018-05-05 21:58

本文选题：偶氮染料 + 偶氮还原酶　；参考：《中国科学院武汉植物园》2017年博士论文

【摘要】：纺织业和印染业是我国染料使用的主要行业。随着染料用量的逐年增加,染料废水排放导致的环境污染问题也日益凸显。目前,印染业使用的染料包含大量人工合成的偶氮染料。偶氮染料的结构比较稳定,自然条件下能够抗碱、抗酸和抗光降解。排放到环境中且含偶氮染料的废水对生物体具有潜在的三致效应(致癌、致畸、致突变)。希瓦氏菌属的模式生物ShewanellaoneidensisMR-1在微氧条件下能够降解偶氮染料,但降解过程在好氧条件下被抑制。目前,关于S.oneidensisMR-1偶氮还原过程的机理以及氧抑制该偶氮还原过程的机理研究甚少。此外,作为降解偶氮染料的关键酶,蛋白质数据库中暂无S.oneidensis MR-1偶氮还原酶(soAzoR)的晶体结构。因此,有关soAzoR的活性位点以及其与底物等的相互作用方式研究也较少。为阐明上述机制,本研究采用基于NMR的代谢组技术和基于RNA-Seq的转录组技术分析了Soneidensis MR-1在不同氧条件下以甲基橙为底物时代谢水平和转录水平的变化;采用同源建模、分子对接以及单氨基酸突点等方法分析了 soAzoR与FMN、NADH和底物(甲基红)的作用方式及作用位点。主要研究结果如下:(1)在代谢组水平上:S.oneidensisMR-l在低浓度溶解氧条件下培养时,甲基橙的存在与否对代谢物含量无显著影响(p0.05)。甲基橙浓度相同时,溶解氧浓度的增加导致SoneidensisMR-1细胞内8种代谢物(脂蛋白脂、丙氨酸、乙酸异戊酯、异丙醇、别苏氨酸、3-羟基丁酮、丙氨酸、腐胺和NAD+)的含量显著性增加(p0.05)。(2)在转录组水平上:SoneidensisMR-1在低浓度溶解氧条件下培养时,甲基橙的存在导致146个基因上调,26个基因下调;SoneidensisMR-1糖代谢能力,TCA循环能力,氨基酸降解能力和电子传递能力增加,尿素循环能力和合成精氨酸能力降低。甲基橙浓度相同时,溶解氧浓度的增加导致S.oneidensis MR-1的312个基因上调,759个基因下调;SoneidensisMR-1脂肪酸氧化能力、氨基酸合成能力、DNA复制能力和尿素循环的能力增加,TCA循环能力、电子传递能力以及氨基酸降解能力降低。(3)结合代谢组和转录组数据提出假设:soAzoR与呼吸链电子传递复合体I想毗邻,偶氮还原过程可以看作呼吸电子传递的一个分支;氧分子作为呼吸电子传递链的终端电子受体,与偶氮染料竞争性的接受电子。(4)soAzoR的三维结构一共包含6个α-螺旋和7个β-折叠,采用典型的罗斯曼折叠构象,酶的活性口袋只能通过同源二聚体形成。(5)辅基FMN的异咯嗪环以平面的方式结合在soAzoR的疏水性口袋中。FMN分别与来自于单体B的氨基酸残基Met94、Tyr95、Asn96、Phe97、Gly140、Gly141、Gly143、Thr138、Ser10、Ser16、Gln17、Ser18 之间生成氢键;与来自单体B的氨基酸残基Leu12、Pro93、Asn176、Arg139以及来自单体A的氨基酸残基Leu8之间均有疏水性作用。(6)辅酶NADH的烟酰胺基团和腺嘌呤核苷酸基团分别结合与酶的不同部位。烟酰胺基团结合于FMN的异咯嗪环si面上方的疏水性口袋中并与该平面呈一定的角度。烟酰胺C4原子到FMN异咯嗪环N5原子之间的距离为4.3 A。NADH分别与来自单体A的氨基酸残基Ala111、Tyr119、Arg59以及来自单体B的氨基酸残基Ser16之间生成氢键;与来自单体A的氨基酸残基Leu58、Phe117、Phe161以及来自单体B的氨基酸残基Gln17、Tyr15之间均有疏水性作用。(7)甲基红(MR)的对氨基苯基团平面以与FMN异咯嗪环si面呈30°角的模式结合在soAzoR的疏水性口袋中。偶氮键到FMN异咯嗪环N5原子的距离约为4.6A。MR分别与氨基酸残基Asn96(B)、Gly140(B)、Gly141(B)、以及氨基酸残基Tyr119(A)之间生成氢键;与氨基酸残基Tyr95(B)、Phe97(B)以及氨基酸残基Phe1 17(A)、Phe161(A)之间均有疏水性作用。(8)酶动力参数分析结果显示:与野生型酶相比,突变体G140F和G141F完全丧失了降解甲基红的能力;突变体S16A和N96A的甲基红和NADH亲和力均降低至少50%;突变体F161A彻底活性;突变体F117A的NADH亲和性提高,且降解甲基红和利用NADH的活性也同时提高;突变体Y119A的NADH亲和力降低;突变体R139A对甲基红的亲和性降低至少4倍,而对NADH亲和力基本不变;突变体H143A降解染料的活性降低至19%,对甲基红的亲和力也大幅降低;突变体R59A对降解甲基红和利用NADH的能力影响较小。
[Abstract]:The textile industry and printing and dyeing industry are the main industries for the use of dyes in our country . With the increasing of dye consumption , the problem of environmental pollution caused by the discharge of dye wastewater is becoming more and more prominent . At present , the dyes used in printing and dyeing industry contain a large number of azo dyes artificially synthesized . The structure of azo dyes is stable and can resist alkali , acid and light degradation under natural conditions . The results were as follows : ( 1 ) When the concentration of methyl orange is the same , the increase of dissolved oxygen concentration leads to up - regulation of the metabolic level and transcription level in the presence or absence of S . oneidensis MR - 1 under different oxygen conditions . ( 5 ) The three - dimensional structure of coenzyme NADH contains 6 alpha - helix and 7 尾 - folds . The distance between nicotinamide and amino acid residues Leu12 , Tyr95 , Asn96 , Phe97 , Ser10 , Ser16 , Gln17 , Ser18 and amino acid residues Leu8 from monomer A are respectively bonded to different parts of enzyme . ( 7 ) The p - aminophenyl group plane of methyl red ( MR ) was bonded to the hydrophobic pouch of soxR at 30 掳 angle with the FMN isoalloxazine ring si . The distance between the azo bond and the amino acid residues Asn96 ( B ) , Gly140 ( B ) , Gly141 ( B ) , and Phe161 ( A ) was reduced at least 50 % ; the affinity of mutant strain F161A was reduced ; the activity of mutant R139A decreased to 19 % , the affinity of mutant H143A was reduced to 19 % , and the affinity of mutant R59A to degradation methyl red and utilization of NADH was less .

【学位授予单位】：中国科学院武汉植物园
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：X791

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