Bna05菌株抗霉成分的分离鉴定及对稻谷防霉效果研究

发布时间：2018-05-21 08:39

本文选题：Bna05菌株 + 抗霉活性物质　；参考：《中南林业科技大学》2017年博士论文

【摘要】：霉变是导致粮食贮藏期品质下降和重量损失的主要原因。稻谷因其生长环境高温高湿的特点,储藏期内极易发霉变质和积累霉菌毒素。传统化学药物的使用对环境造成的负面影响和病原菌逐年增强的抗药性问题,使得开发生物源的新型稻谷防霉剂成为农业可持续发展的必然需求。本论文以前期研究中分离到的具有高抗霉活性的纳豆芽孢杆菌Bna05菌株为发酵菌种,通过发酵工艺优化、抗霉活性物质分离鉴定、抗霉作用机制研究和稻谷防霉试验研究,旨在探明Bna05菌株抗霉活性物质主要成分和功能,为开发广谱、安全、高效的稻谷防霉剂提供理论依据。通过单因素实验及响应曲面设计对Bna05菌株产抗霉活性物质的液体发酵工艺进行了优化,确定了该菌株产生抗霉活性物质的适宜条件为:温度30 ℃、培养时间37h、初始pH值6.6。适宜的培养基配方为:大豆蛋白胨(或胰蛋白胨、蛋白胨)1 g、葡萄糖 2g、牛肉膏 0.3g、Na2HPO40.15g、KH2PO40.1g、酵母浸出粉 0.3g、谷氨酸0.06 g、天冬氨酸0.06 g、水100 mL。优化后所得Bna05发酵上清液的抑霉率为87.02%,比发酵工艺优化前提高了 65.69%。利用抗菌脂肽合成酶类基因片段的特异性引物对Bna05菌株的基因组DNA进行扩增、测序和Blast比对,结果表明:Bna05菌株含有sfp和srfAA基因,未检测到ituC、ituD、fenD、feiACE、bymB、bymC基因的存在。Bna05菌株发酵上清液的固相萃取物经RP-HPLC分离后,得到三组抗霉活性物质:F2、F3和F4,通过微孔板比色法测得F2、F3和F4对黑曲霉的MIC50值分别为50、200和100μg/mL。质谱鉴定的结果,发现F3中存在两种V7-surfactin异构体,样品F4中存在三种I/L7-surfactin同系物。对F2进行LC/MS/MS分析的结果发现F2中存在与Subtilisin、Fibrinolytic enzyme和Serine alkaline protease结构类似的小分子蛋白类物质,这些小分子抗菌蛋白的存在,应该是样品F2表现出较强抗霉活性的主要原因。通过对受试霉菌进行PI染色观察、核酸及蛋白泄露情况测定、光学和扫描电镜观察的结果表明:经F2处理后的黑曲霉孢子大部分受到损伤,但未出现细胞裂解;F3、F4能导致部分霉菌孢子破裂,但对未破裂的孢子损伤较小;F2、F3和F4均能引起黑曲霉核酸和蛋白泄露,泄露量在处理的前3h呈快速增长趋势。光学显微镜观察的结果表明,F2、F3、F4均能延迟黑曲霉孢子的萌发和抑制菌丝生长。F2存在条件下的黑曲霉生长过程中易出现大量结团,F3、F4存在条件下的黑曲霉菌丝附近出现疑似胞内物质泄露物形成的泡状物,F4所导致这种泄露现象比F3更明显。扫描电镜观察的结果显示,经F2、F3、F4处理后的黑曲霉菌丝均呈现萎蔫、局部凹陷、表面粗糙、生长受抑等特征;而对照组菌丝则生长旺盛、菌丝饱满、表面光滑。初步的协同抗霉试验结果表明,V7-surfactin、I/L7-surfactin均能与F2发生抗霉协同作用,两类Surfactin之间无抗霉协同作用。对Bna05菌株发酵上清液固相萃取物SPEL进行抗霉菌谱测定和稳定性分析的结果表明,SPEL对黑曲霉、黄曲霉、根霉、青霉和烟曲霉均有较好的抑制效果。SPEL对高温和酸碱均具有一定的耐受性,但应避免80 ℃以上的高温、强酸、强碱及与Mg2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+接触或混合使用。稻谷防霉试验研究结果表明,每g稻谷中加入300 μg SPEL时,可将稻谷中的霉菌数由对照组中的严重危害级降低到临界级,脂肪酸度所对应的储存品质指标由重度不宜存降低为宜存,同时,黄曲霉毒素B1的含量比对照组降低了 74.0%。试验过程中还发现SPEL对稻谷发芽具有良好抑制效果。说明SPEL具有作为新型稻谷防霉保鲜剂的开发研究价值。
[Abstract]:The results showed that Bna05 strain contained sfp and srfAA gene . The results showed that Bna05 strain contained sfp and srfAA gene . The results showed that Bna05 strain contained sfp and srfAA gene . The results showed that Bna05 strain contained sfp and srfAA gene . The results showed that Bna05 strain contained sfp and srfAA gene . The results showed that the spores of Aspergillus niger in the presence of F2 , F3 and F4 could inhibit the germination of Aspergillus niger spores and inhibit the growth of Aspergillus niger . The results showed that the presence of F2 , F3 and F4 could delay the germination of Aspergillus niger spores and inhibit the growth of Aspergillus niger . When 300 渭g of SPEL was added to each g of rice , the number of moulds in the rice can be reduced to the critical level by the serious hazard level in the control group , and the storage quality index corresponding to the fatty acid degree decreased by 74.0 % from the control group . Meanwhile , the content of aflatoxin B1 decreased by 74.0 % compared with the control group .
【学位授予单位】：中南林业科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TQ920.1;TS210

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