产阿卡波糖放线菌的选育、发酵条件优化及代谢调控研究

发布时间：2018-12-15 23:57

【摘要】：α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类通过延缓肠道内糖类物质的消化吸收而达到治疗糖尿病的口服降糖药物。阿卡波糖(acarbose)是由放线菌产生的结构与寡糖类似的化合物,这种化合物对寡糖酶的活性具有抑制作用。这类降糖药能抑制人体消化道对糖类的吸收,能够用于II型糖尿病的治疗。本论文研究产阿卡波糖放线菌的选育、诱变和发酵条件优化以及代谢调控。从土壤中筛选产阿卡波糖的放线菌,采用常压室温等离子体诱变系统对该菌进行诱变育种,采用推理育种的筛选方法,获得了阿卡波糖的高产菌株,采用两阶段发酵法,大幅度地提高了阿卡波糖的产量。采用海藻酸钠凝胶添加粉末活性炭,研究固定化对放线菌发酵产阿卡波糖的影响。最后研究了糖酵解抑制剂氟化钠和碘乙酸对放线菌发酵产阿卡波糖的代谢调控作用。本文的主要研究内容如下:1、在分离放线菌的过程中,将土壤样品室温风干5天,然后将土壤稀释液于60°C进行加热处理20 min,在高氏一号固体培养基中添加100 mg/L的K2Cr2O7,抑制细菌、酵母菌、霉菌的生长繁殖,提高了放线菌的筛选效率,有利于放线菌的分离。2、建立了发酵液中阿卡波糖含量快速测定的薄层色谱法。采用Merck薄层层析硅胶板,以正丙醇:水=8:2(v/v)为展层剂,以含10%(v/v)的磷酸、2%(v/v)的苯胺,2%(w/v)的二苯胺的丙酮溶液作为显色剂。层析板上的阿卡波糖通过喷显色剂后,于110°C烘干10 min,阿卡波糖的最大吸收波长为540 nm,在2.0-10.0μg范围内,峰面积y对阿卡波糖含量x(μg)线性回归分析得到方程:y=108.27 x+432.61(r2=0.9997)。该测定方法具有操作简单、快速的优点,可以用于快速分析大批量的样品,为菌种的高通量筛选提供了快速分析方法。筛选到一株放线菌JN537,其阿卡波糖产量达1830 mg/L。3、采用ARTP诱变系统对放线菌JN537进行诱变育种,诱变条件为:处理距离2mm、诱变时间2 min、处理温度30-40°C、气体流速2.5 L/min、致死率为90.4%。用推理育种方法,选育对青霉素抗性敏感突变菌株,其细胞壁合成能力较弱,合成细胞壁的前体物质(多糖、氨基酸)转向合成阿卡波糖,达到选育阿卡波糖高产菌株的目的。从青霉素抗性敏感突变菌株中筛选到一株阿卡波糖高产菌株StreptomycesM37,其阿卡波糖的产量达2974 mg/L,比出发菌株提高了62.5%。通过薄层色谱法测定细胞壁单糖的组成和含量,与出发菌株相比,该突变菌株StreptomycesM37的细胞壁的葡萄糖和核糖的含量分别减少了23.1%和31.6%。通过高效液相色谱法测定细胞壁的氨基酸含量,突变菌株的细胞壁二氨基庚二酸和甘氨酸的含量减少了16.4%和27.2%。研究表明:通过10次传代,该突变菌株的阿卡波糖产量比较稳定。4、研究了pH值对细胞生长和代谢产物积累的影响。实验结果表明,pH 7.0有利于放线菌菌体细胞的生长,但不利于阿卡波糖的合成;pH 8.0有利于阿卡波糖的合成,但不利于菌体细胞生长。pH值8.0时,分批发酵的阿卡波糖产量最高,达3345 mg/L。在放线菌发酵的第72 h,添加0.1 mol/L NH4Cl有利于阿卡波糖的合成;向培养基中添加葡萄糖和麦芽糖的质量比为1:2(还原糖的总添加量为20 g/L),有利于Streptomyces M37合成阿卡波糖。由此提出了两阶段培养模式:在发酵的前72 h控制pH值为7.0,促进菌体细胞的生长;在发酵后期控制pH值为8.0,在发酵后期添加阿卡波糖合成的前体物质(NH4Cl、葡萄糖和麦芽糖),通过两阶段发酵,阿卡波糖的产量达6210mg/L提高了85.7%。采用两阶段培养模式,G6PDH和GDH活性的增加,有助于阿卡波糖的合成。5、在2%的海藻酸钠凝胶中添加1.5%的粉末活性炭有助于放线菌StreptomycesM37的固定,扫描电镜观察表明添加粉末活性炭后的胶珠具有多孔性。粉末活性炭表面粗燥、具有亲水性,有助于放线菌Streptomyces M37的固定化和物质传递。与游离细胞发酵相比,阿卡波糖的产量提高了23.9%达5465 mg/L,发酵过程中细胞的渗漏量降低了61.3%,发酵时间缩短为96 h。6、研究糖酵解抑制剂氟化钠和碘乙酸对放线菌发酵产阿卡波糖的影响。在放线菌发酵的第72 h,添加2 mg/L的碘乙酸,阿卡波糖的浓度提高了12.1%。在放线菌发酵的第96 h,添加15 mg/L的氟化钠,阿卡波糖的浓度提高了14.6%。在放线菌发酵的第72 h添加1.5 mg/L的碘乙酸、在放线菌发酵的第96 h添加10 mg/L的氟化钠,阿卡波糖的产量达到5358 mg/L,比对照组提高了21.5%。添加碘乙酸和氟化钠后,3-磷酸甘油醛脱氢酶和烯醇化酶的比活力分别下降了19.6%和21.0%;与此同时,6-磷酸葡萄糖脱氢酶的比活力平均升高了34.5%,使碳源更多地流向HMP途径,为阿卡波糖的生物合成提供更多的前体物质。研究表明碘乙酸和氟化钠对放线菌合成阿卡波糖的代谢调控有协同促进作用。
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【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TQ920.1;TQ464

【参考文献】