【摘要】：西藏芜菁(Brassica rapa L.)是在高寒低氧的恶劣环境下孕育出来的药、食、饲三用植物。传统的藏医学典著和现代的《四川省藏药材标准》等对西藏芜菁有着详细的性状描述和功效记载,表明其具有"清热解毒"、"滋补增氧"、"治疗身体虚弱"、"祛风"等功效。同时,本课题组前期的研究及文献报道均表明西藏芜菁块茎的醇提物、水提物和全粉等均具有良好的抗缺氧功效。然而,对于西藏芜菁的抗缺氧有效成分及其作用机制方面的研究尚未见报道。因此,本文首先采用人体试食试验对西藏芜菁微粉的抗缺氧功效进行验证。接着,以dPC12细胞在缺氧条件下的低细胞活力为依据,建立物理缺氧和化学缺氧模型,通过体外评价明确西藏芜菁中具有缺氧神经损伤防护功效的部位,并对该部位进行有效成分的分离、制备、纯化和结构解析。最后,分别从细胞水平和整体动物水平对有效化合物的抗缺氧功效及其作用机制进行研究。主要研究内容及成果如下:1.采用为期7天的人体试食试验,结合低氧耐受测试(hypoxia inhalation test,HIT)(模拟7500 m海拔高度,氧含量7.1%)、运动心肺功能测试(Bruce方案)和血生化指标检测,考察了连续摄取西藏芜菁微粉(7.5 g× 2次/天)对普通健康人群低氧耐受力的影响。结果显示,西藏芜菁微粉能有效提高机体在HIT中的SpO2,缓解缺氧的不良症状,对机体的抗氧化能力具有显著改善作用(P0.05)。运动心肺功能测试表明芜菁微粉可以显著延后受试者的无氧阈出现时间、提高男性受试者的最大氧脉搏和女性受试者的最大公斤体重摄氧量(P0.05)。此外,芜菁微粉还能显著增加男性受试者血液中的平均血红蛋白浓度(P0.05)。进一步印证了西藏芜菁提高健康人群低氧耐受的功效。2.采用类神经dPC12细胞(differentiated PC12 cell)株,分别建立物理缺氧和化学缺氧两种体外评价模型。物理缺氧的造模条件:培养箱气体组成比例为:0.5%O2+5%CO2 + 94.5%N2,培养时间36h;化学缺氧的造模条件:CoCl2浓度为300μmol/L,培养时间36h。西藏芜菁干粉用无水乙醇热回流提取,然后采用有机溶剂进行分级萃取、获得不同极性的部位。体外活性评价表明,正丁醇-乙酸乙酯相(中等极性部位)对缺氧导致的dPC12细胞损伤具有较好的防护作用,认定其为芜菁抗缺氧的有效活性部位。3.采用硅胶柱层析、固相萃取、制备型液相色谱等技术手段对上述有效部位进行分离、纯化和制备,从中得到10个单体化合物;并采用LC/Q-TOF/MS、NMR和X-单晶衍射等手段鉴定出6个酚酸类化合物,分别为4-羟基-苯甲酸葡萄糖苷、反式-对香豆酸葡萄糖苷、顺式-对香豆酸葡萄糖苷、反式-阿魏酸葡萄糖苷、阿魏酸和芥子酸。运用dPC12细胞体外评价模型,筛选出其中抗缺氧活性优良的化合物为:反式/顺式-对香豆酸葡萄糖苷(cis/trams-p-coumaric acid-β-D-glucopyranoside),且以反式结构为主要存在形式。4.研究反式-对香豆酸葡萄糖苷(CG)对物理缺氧(0.5%O2)条件下细胞损伤的防护作用及其机制。用浓度为5～50μmol/L的CG处理dPC12细胞能够有效增加细胞活力、降低细胞中LDH的释放、减少细胞凋亡,并呈现良好的剂量依赖关系。同时,50μmol/L的CG能显著抑制缺氧导致的dPC12细胞线粒体膜电位的下降和细胞色素C的释放,提升细胞中抗凋亡蛋白(Bcl-2/Bax和Bcl-XL)的表达,降低促凋亡蛋白(Caspase-3和Caspase-9)的活力(P0.05)。此外,qRT-PCR分析结果表明,CG同时也影响了编码上述蛋白的mRNA水平。5.根据《保健食品检验与评价技术规范》中的抗缺氧评判标准,采用ICR小鼠常压耐缺氧试验进一步验证西藏芜菁的有效部位。连续30天灌胃50 mg/kg.bw/d的西藏芜菁正丁醇相,能够显著延长雄性小鼠的缺氧存活时间(P0.05),显示出较好的抗缺氧功效。接着,采用急性缺氧动物模型,研究了正丁醇相及其特征性化合物(CG)的苷元----香豆酸(CA)的抗缺氧相关机制,试验周期为7天,灌胃给药。急性缺氧条件为:15 min内将低氧氧舱中氧含量从21%降至9.5%,保持6 h。结果显示,急性缺氧模型显著增加了小鼠肺的含水量(P0.01),而正丁醇相(50 mg/kg.bw/d)和不同剂量的 CA(25、100 mg/kg.bw/d)均能有效抑制肺含水量的升高(P0.05);生化分析表明,其机制可能与提高急性缺氧条件下肺组织中Na+,K+-ATP酶活力、增强抗氧化能力(SOD↑、CAT↑和MDA↓)、抑制炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的升高有关。此外,50 mg/1kg.bw/d的正丁醇相对急性缺氧导致的小鼠脑组织中ATP的下降有一定的阻滞作用,可能与提高大脑无氧酵解相关酶(PK、PFK和LDH)的活力有关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TS218
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本文编号：2383333
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