几类蛋白酶催化机理的理论研究

发布时间：2019-12-04 22:43

【摘要】：酶催化反应具有显著的高效性、催化专一性、反应条件温和等优点,深入研究酶催化机理不仅有助于理解酶的生物学功能,还可为酶改造及应用奠定良好的理论基础。通过实验可以对酶的结构、反应动力学和突变机制等方面进行研究,但是由于蛋白酶结构及催化过程的复杂性,在酶催化机理研究方面仍有许多问题需要解决,例如仅凭实验方法无法系统地表征酶反应中涉及到的中间体、过渡态的结构以及各步基元反应、决速步骤、能量学信息等。理论计算方法可以在分子水平上对酶催化反应进行研究,与实验方法得到的数据进行相互验证和补充。近年来,计算酶学领域发展迅速,越来越多的研究者通过高性能计算进一步揭示了酶催化过程的机制。随着计算软件的飞速发展以及理论计算方法的日趋完善,计算化学在大尺度生化体系研究中的应用越来越广泛,现在已经成为研究酶催化反应机理的重要工具之一。本论文主要采用分子对接、分子动力学模拟、量子化学和分子力学结合方法(QM/MM)在原子水平上对几类含有辅因子的蛋白酶催化过程进行深入研究,综合运用理论化学方法揭示这些酶催化过程中涉及的一些科学问题,如底物在酶活性中心的结合模式及酶-底物复合物的活性状态,辅酶因子(金属铁离子、黄素和磷酸吡哆醛)在催化反应中所起的不同作用,催化反应的详细机理以及反应过程中过渡态和中间体的构型和相关能量学信息,反应过程中的电子转移及关键残基的重要作用等。通过对这些问题的深入研究,在原子水平上阐明了这些蛋白酶催化过程的微观机制,尤其是论文研究中涉及的几种蛋白酶的晶体结构均为近几年获得,酶活性中心含有价态和自旋变化复杂的金属铁离子或者结构易变的新型有机小分子辅因子,它们的催化过程比一般蛋白酶的催化过程更为复杂。本论文研究不仅揭示了这几种蛋白酶的催化机制,还可为类似酶的研究、仿生催化剂的设计、酶工程及酶的应用提供重要的参考,具有重要的科学意义和应用前景。论文研究工作主要包括以下几个方面:(1)粪卟啉Ⅲ氧化脱羧酶HemQ催化机理研究粪卟啉Ⅲ氧化脱羧酶(HemQ)是一类过氧化氢依赖酶,在血红素的生物合成过程中,HemQ在过氧化氢的氧化作用下催化卟啉环上的两个丙酸侧链发生连续脱羧反应生成血红素。2017年,实验工作者表征了 HemQ的晶体结构,并根据实验结果建议了大致的反应机理,但详细的催化机理尚不明确。另外,实验研究发现残基Tyr144对两个丙酸侧链P2和P4的脱羧都至关重要,但在HemQ的晶体结构中,P4丙酸侧链距离Tyr144较远,残基Tyr144在脱羧过程的作用也不清楚。本论文采用QM/MM方法对HemQ催化coproheme III连续脱羧反应的机理进行了研究。计算结果阐明了催化反应机理:P2首先抽取残基Tyr144上的质子并通过质子耦合电子转移过程引发催化反应;然后Tyrl44自由基夺取P2上Cβ的氢原子形成Cβ自由基;最后底物发生分子内电子转移导致丙烯侧链的脱羧。其中Cβ-H键的裂解是整个催化反应的决速步骤。另外,根据QIM/MM计算结果我们建议了其它可能的催化反应路径,在该路径中残基Val199和Tyrl44共同作为氢原子传递通道。P2脱羧完成之后,我们对丙酸侧链P4的脱羧机理进行了研究,并且发现残基Lys148介导的P4脱羧反应非常困难。对接结果表明,形成的中间体harderoheme Ⅲ需要调整结合模式,即先从活性区域离去然后再重新以一种新的结合模式进入活性位点,丙酸侧链P4占据P2的位置,残基Tyrl44继续催化P4的脱羧反应。计算结果揭示了底物与酶的结合模式,明确了 HemQ的催化反应机理,为进一步理解粪卟啉Ⅲ氧化脱羧酶以及血红素的生物合成提供了理论指导。(2)阿魏酸脱羧酶FDC催化机理研究泛醌在有氧细胞呼吸系统电子传递链中起关键作用,而阿魏酸脱羧酶(FDC)参与泛醌前体的生物合成。研究者在大肠杆菌中同时表达了基因fdcl和ubix,得到了阿魏酸脱羧酶的晶体结构,其中辅酶因子呈两种形式,分别为亚胺类辅酶因子和酮亚胺类辅酶因子(prFMNiminium和prFMNketimine),作者首次提出了阿魏酸脱羧酶的1,3-偶极环加成的催化反应机理,但是详细的催化过程尚不明确。基于阿魏酸脱羧酶的晶体结构,我们使用QM/MM方法对其脱羧反应机理进行了研究。通过对两类辅酶因子(prFMNiminium和prFMNketimine)的催化活性进行对比,验证了亚胺类辅酶因子具有催化活性,而酮亚胺类辅酶因子不具有催化活性。计算结果阐明了 FDC在辅酶因子prFMNiminium作用下的反应机理:底物和辅酶因子首先通过1,3-偶极环加成生成吡咯烷中间体;然后羧酸基团离去生成CO2;残基Glu282作为质子供体通过一分子水桥将Cα质子化,再次生成吡咯烷中间体;最后五元环中间体通过1,3-偶极环消除反应生成苯乙烯产物。通过对反应势能剖面的分析发现,Cα质子化过程为整个反应的决速步,能垒为23.5 kcal/mol。另外,我们还研究了 CO2的离去对反应的影响,结果表明,推迟CO2的离去有利于Cα的质子化进程。酶活性中心的Mrn2+离子能够通过配位键使底物准确结合进酶的活性中心。我们的计算结果为进一步理解阿魏酸脱羧酶提供了理论基础,对泛醌生物合成的研究具有指导意义。(3)麦角硫因合成酶EgtB催化亚砜形成的机理研究麦角硫因是一类天然抗氧化剂,它具有清除自由基、解毒、维持DNA的生物合成、维持细胞的正常生长及细胞免疫等多种生理功能。麦角硫因的生物合成是该领域的研究热点之一。麦角硫因合成酶(EgtB)是一类独特的非血红素含铁酶,它专一性的将底物γ-谷酰基半胱氨酸(γGC)和N-α-三甲基组氨酸(TMH)催化生成亚砜。研究者表征了 EgtB的晶体结构,建议了 EgtB的催化反应机理。但是底物N-α-三甲基组氨酸的砜化过程和C-S键的形成过程的先后顺序是一个存在争议的问题,具体的反应细节也不明确。我们采用QM/MM方法对EgtB的催化反应机理进行了研究,结果表明氧气分子与铁中心的配位模式有两种(“end-on”模式和“side-on”模式),但是只有“end-on”模式具有反应活性。对于初始反应物,底物-Fe(Ⅱ)-O2复合物的电子结构可描述为yGC-Fe(Ⅲ)-O2·-和γGC·-Fe(Ⅱ)-O2·-的杂化,开壳层单重态为反应物基态,但是五重态对应的反应能垒较低。由于底物γGC和Fe(Ⅱ)-O2复合物之间的电子转移导致γGC的S原子带有自由基特性,有利于Fe(Ⅱ)-O2对S原子的进攻。通过计算揭示了反应的详细机制,Fe(Ⅱ)-O2复合物首先与γGC形成四元环氧化物Fe-O-O-S,然后底物γGC的砜化过程伴随着环氧化物Fe-O-O-S的开环,对应的能垒为6.0 kcal/mol;接下来,FeⅣ=O复合物抽取TMH的C2上的质子,形成C2负离子。C2负离子的形成过程为整个反应的决速步,能垒为21.7 kcal/mol。一旦形成C2负离子,便很容易生成产物2-组氨酸-半胱氨酸亚砜。计算表明,砜化过程发生在C-S成键过程之前。另外,我们对残基Tyr377在反应过程中的作用进行了探讨。FeⅣ=O复合物从Tyr377上抽取质子非常容易,但是,形成的酚氧负离子并不能顺利抽取TMH的咪唑环上的质子。我们的研究结果有助于进一步理解麦角硫因的生物合成以及相关酶的催化机制。(4)PLP依赖酶Egt2催化亚砜裂解的理论研究麦角硫因合成酶Egt2是一类PLP依赖酶,主要催化麦角硫因生物合成过程中最后一步亚砜的C-S键裂解反应,是麦角硫因生物合成路径中必需的一种酶。虽然实验上已经对C-S键裂解酶的结构和功能进行了大量的研究,但对于Egt2的催化反应机理尚不清晰。2018年,研究者在大肠杆菌中表征了 Egt2的晶体结构并且发现活性区域位于两个亚基的界面处,辅酶因子PLP和残基Tyr134之间存在π-π堆积效应,但是残基Tyr134的具体作用尚不明确。基于Egt2的晶体结构,我们采用QM/MM方法对亚砜裂解酶Egt2的催化反应进行了深入研究,给出了最可能的反应路径,反应由四个基元反应组成:Cα去饱和化反应、亚砜裂解反应、赖氨酸加成反应以及氨基丙烯酸的形成反应。在氨基丙烯酸的形成过程中,残基Lys247与PLP-氨基丙烯酸的C1=N1双键发生加成反应,然后发生分子内质子转移过程。分子内质子转移过程为整个催化循环的决速步,能垒为22.5 kcal/mol。探讨了保守残基的作用,去质子化的Tyr134残基可以作为催化酸碱来夺取Cα位置的质子,之后介导亚砜基团的裂解。通过理论计算揭示了辅酶因子PLP在Egt2酶中的催化反应本质,修正了先前实验上建议的Egt2的催化机理,这些计算结果为麦角硫因生物合成路径的机理研究提供了新的视角和启示。本论文特色和创新之处(1)从理论上阐述了粪卟啉Ⅲ氧化脱羧酶的催化机理,揭示了残基Tyr144和丙酸侧链之间的质子耦合电子转移过程是启动氧化脱羧反应的关键,证实了 P2脱羧后的中间体需要重新结合到活性中心才能发生P4的脱羧。(2)阐明了阿魏酸脱羧酶的1,3-偶极环加成的脱羧机理,通过对辅酶因子prFMNiminium和prFMNketimine的对比研究揭示了亚胺类辅酶因子prFMNiminium具有催化活性的本质。(3)明确了麦角硫因合成酶EgtB中底物、铁中心和氧气之间的结合模式以及电子传递过程,证明了催化反应中Fe-O-O-S中间体的形成是催化反应的必需步骤,确定了亚砜形成过程和C-S成键过程的先后顺序以及具体的反应细节,解决了机理研究上存在的争议。(4)确定了麦角硫因合成过程中的亚砜裂解酶Egt2的催化反应机制,修正了前期实验上建议的反应机理,给出了催化反应的最可能路径;揭示了辅酶因子PLP以及残基Tyr134在催化中的关键作用。
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物的情况下就需要借助对接手段来获取合理的酶－底物复合物，例如，将Ｌ－赖氨酸逡逑分子对接到甲基鸟氨酸合成酶中，来研究甲基鸟氨酸合成酶结合赖氨酸的反应［２）逡逑（图２－１）。目前比较常用的对接软件有ＳＬＩＤＥ［３］、ＤＯＣＫｗ、ＡｕｔｏＤｏｃｋ［５＾，本论逡逑文采用半柔性对接，使用的是ＡｕｔｏＤｏｃｋ软件。ＡｕｔｏＤｏｃｋ里采用格点对接方法，模逡逑拟淬火和拉马克遗传算法来搜寻生物大分子和配体小分子的最佳结合方式，使用半逡逑经验的自由能打分函数计算方法来获取二者之间的识别匹配情况。逡逑２．２分子力学和分子动力学方法逡逑分子力学（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｍｅｃｈａｎｉｃｓ）和分子动力学方法（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｄｙｎａｍｉｃｓ，邋ＭＤ）逡逑都是采用分子力场参数通过积分算法求解Ｎｅｗｔｏｎ运动方程的过程。分子力学和分逡逑子动力学模拟的区别在于前者是经验力场模型，以原子为质点，服从经典力学运动逡逑规律；而分子动力学求解的是随时间变化的分子的状态、行为和过程。逡逑２．２．１分子力学方法逡逑分子力学是以给定的分子模型为基础，，对给出的分子试探结构采用经验势函数逡逑表征结构单元之间的相互作用，从试探构象附近筛选出能量极值点和相应的结构。逡逑１８逡逑

大分子体系的研究中，ＱＭ部分主要包括底物小分子、辅酶因子、部分水分子以及逡逑活性区域内的部分残基；而其余的蛋白质部分以及周围的溶剂分子则为ＭＭ区（如逡逑图２－２所示）。ＱＭ／ＭＭ方法一定程度上结合了邋ＱＭ方法的准确性（用来描述化学逡逑键的变化以及电子转移情况）和ＭＭ方法的计算速度（用来描述蛋白质环境对反应逡逑的影响）。体系的总能量不能简单地描写为ＱＭ区和ＭＭ区的能量总和，需要考虑逡逑ＱＭ区和ＭＭ区之间相互作用的耦合项￡■＿＿＿。针对区域间相互作用的处理办法逡逑—共有两种方案：减法方案（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ邋ｓｃｈｅｍｅ）和加法方案（ａｄｄｉｔｉｖｅ邋ｓｃｈｅｍｅ）。逡逑减法方案中体系的总能量被描述为：逡逑＝邋ＥｑＪＱＭ）邋＋邋Ｅ，ｍ（Ｓ）邋－邋Ｅｍ（ＱＭ）逦（２．３）逡逑其中＾

本文编号：2569795