抗氧化肽的构效关系及定向制备的研究

发布时间：2020-07-12 18:53

【摘要】：肽的抗氧化活性被得到广泛认可,且具有营养价值高及吸收快等优点。因此,抗氧化肽在开发延缓衰老的保健食品中具有极大的应用前景。然而,目前对于食源性抗氧化肽的研究仍处于实验室阶段,对于抗氧化肽的构效关系及定向制备等方面的研究还不够深入和系统,因而较难进行产业化推广。本论文对氨基酸及二肽的体外抗氧化活性进行了系统的研究,探讨了影响二肽体外抗氧化活性的关键性因素,并研究了抗氧化二肽的定量构效关系,旨在为后续抗氧化肽蛋白原料的定向筛选及目标抗氧化肽的高效制备提供理论指导。本论文的主要研究内容和结果如下:(1)探讨了DPPH及ABTS法评价氨基酸及肽类物质抗氧化活性时存在的问题并对其进行适当的改进。结果表明,在DPPH法中,碱性氨基酸Arg会使DPPH?还原后的产物DPPHH发生去质子化反应,导致在检测波长515-525 nm处有很强的吸收强度,从而对该方法的检测产生干扰;采用醋酸盐缓冲溶液,并控制这个反应体系的最终pH值维持在弱酸环境中,可以避免上述干扰。在ABTS法中,不同的氨基酸及二肽清除ABTS?+的能力受pH影响不同,其中Tyr、Trp及其相关的二肽清除ABTS?+的反应速率随着pH值的升高而加快,而Cys及其相关的二肽则受pH影响较小;在pH 7.4下,所有检测的氨基酸及二肽清除ABTS?+在常用的6-10 min的反应时间内均不能达到反应终点,至少需要反应30 min才能基本达到平衡。(2)研究了20种氨基酸及40种二肽在ABTS、ORAC、DPPH、还原力及Fe2+离子螯合能力等方法中的抗氧化活性,探讨了抗氧化氨基酸对二肽体外抗氧化活性的影响,并进一步通过测定9种多肽的抗氧化活性进行验证。结果表明,在ABTS及ORAC法中,Tyr、Trp及含有Tyr/Trp残基的二肽均具有非常强的自由基清除活性(Trolox当量为0.74-5.90μmol TE/μmol),其次为Cys、Met及含有Cys/Met残基的二肽(Trolox当量为0.14-2.00μmol TE/μmol),而其余不含Tyr、Trp、Cys或Met的二肽则基本无活性;在DPPH及还原力法中,只有Cys及含Cys残基的二肽具有明显的抗氧化活性(Trolox当量为0.12-0.85μmol TE/μmol);在Fe2+螯合能力方面,这些氨基酸及二肽均没有检测到活性。这说明了Tyr、Trp、Cys及Met等4种抗氧化氨基酸是决定二肽抗氧化活性的关键性因素。经测定9种多肽的体外抗氧化活性也验证了这个规律。(3)研究了不同类型的二肽在AAPH诱导的血红细胞氧化损伤模型中溶血的保护作用,探讨了抗氧化氨基酸对二肽在血红细胞氧化损伤模型中保护作用的影响,并进一步以Tyr-Gly、Trp-Gly、Cys-Gly及Met-Gly为研究对象,探讨了其保护作用机制。结果表明所有含Tyr、Trp、Cys及Met残基的二肽对AAPH诱导的血红细胞溶血均具有一定的保护作用,其中含Trp残基的二肽保护作用最强,而其余不含这四种抗氧化氨基酸残基的二肽则基本无保护作用。此外,Tyr-Gly、Trp-Gly、Cys-Gly及Met-Gly等二肽在该模型中对血红细胞溶血的保护作用均具有时间及浓度依赖关系,并能降低血红细胞中血红蛋白的氧化程度以及延缓血红细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)的消耗。这些二肽主要是通过清除ROO?,阻断自由基链式反应,从而达到保护作用。(4)进一步研究了48种N端或C端含有Tyr/Trp残基二肽的体外抗氧化活性,并通过氨基酸描述符及密度泛函理论对其进行定量构效关系研究。结果表明,大部分二肽其序列中Tyr/Trp残基在N端比其在C端具有更强的ABTS?+及ROO?清除能力,且其邻位氨基酸残基对二肽的抗氧化活性也有一定的影响;DPPS模型表明含Tyr残基的二肽其序列中C端氨基酸残基的空间立体大小、疏水性、氢键形成能力及电性与其ABTS?+清除能力呈负相关,而其N端氨基酸残基的疏水性及氢键形成能力与其活性呈正相关;密度泛函理论研究表明二肽序列中Tyr及Trp残基侧链基团的前线分子轨道的电子云分布情况及其BDE、IP、PA和ETE值基本不受其邻位氨基酸残基的影响,可能是受场效应、空间效应及氢键作用等因素的影响。(5)基于抗氧化肽的氨基酸组成特点,定向的筛选了适合于制备抗氧化肽的蛋白原料,并通过Sephadex G-25及UPLC-ESI-UHR-TOF-MS/MS技术对目标抗氧化肽进行分离鉴定。结果表明,大米蛋白、酪蛋白、花生分离蛋白、大豆分离蛋白、小麦面筋蛋白及明胶等蛋白原料的酶解产物在ABTS及ORAC法中的抗氧化活性与其蛋白原料中的Tyr、Trp、Cys及Met等抗氧化氨基酸的含量高度相关(尤其是Tyr及Trp),其中富含Tyr和Trp的大米蛋白及酪蛋白的酶解产物抗氧化活性最强,而缺乏Tyr、Trp、Cys及Met等抗氧化氨基酸的明胶其酶解产物抗氧化活性最弱。以大米蛋白为原料对其进行酶解及分离鉴定,最后在大米蛋白复合蛋白酶(Protease M)水解产物中共鉴定出27条含有Tyr或Trp等抗氧化氨基酸残基的肽段,并通过合成验证发现这些肽段均具有较强的抗氧化活性,其中YR、WN、YY、AW、WV、YW、IW、YNPR、TYNPR、GYPR、NWR、WQSS、WQS、IGYPR、LGYPR、LQPY、TNPW、MYPIPR、MYPLPR及VNPW等20条肽段的抗氧化活性强于标准抗氧化剂Trolox。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS201.2

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