微生物细胞催化合成γ-氨基丁酸效能强化的研究

发布时间：2020-09-10 21:01

　　 Y-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)是谷氨酸(Glutamic acid, Glu)经谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase, GAD)催化脱羧生成的产物。GABA作为哺乳动物体内一种重要的抑制性神经递质,具有镇静安神、利尿、降血压等多种生理功能,可作为生物活性因子应用于食品、医药和饲料工业。此外,GABA还可作为前体物质来合成聚酰胺-4(可生物降解材料)等化工产品。本研究采用基因工程手段和细胞透性化技术对GABA高产菌Lactobacillus brevis CGMCCNO.1306和GAD工程菌BL21(DE3)-pET28a-gadB的GABA合成能力进行强化研究,并在此基础上,将谷氨酸脱羧反应与乳酸发酵进行耦合来同时制备GABA和乳酸,主要结果如下：1.以Lb. brevis CGMCC NO.1306为研究对象,采用增加其GABA合成系统关键基因所在操纵子拷贝数的方式来提高其GABA合成能力。对Lb. brevis CGMCC NO.1306基因组中涉及GABA合成的两个操纵子(gadRAC operon和gadB operon)进行了克隆和序列测定,发现这两个操纵子与Lb. brevis ATCC 367相关序列的同源性都高达99%。利用荧光定量PCR技术考察了在控酸发酵条件下Lb. brevis CGMCC NO.1306 GABA合成系统中各个相关基因的转录情况,发现该菌GABA合成能力与gadRCA操纵子上的GAD抗酸系统转录促进因子gadR.GAD基因gadA和Glu-GABA反向转运蛋白基因gadC的表达水平成正相关,而单独处于另一操纵子的GAD基因gadB的表达则与菌体GABA合成能力关系不大。在Lb. brevis CGMCC NO.1306中增加gadRCA操纵子的拷贝数后,工程菌的表观GAD催化活力较原始菌得到明显提高,且其活性在各个时期都明显高于同期原始菌。发酵24 h时,工程菌表观GAD活力达到最大值为0.86 U/mg,是同期原始菌的1.23倍。2.以BL21 (DE3)-pET28a-gadB为研究对象,在其内强化Glu-GABA反向转运蛋白基因gadC的表达,可以有效地促进底物Glu和产物GABA进行跨膜运输,从而削弱了细胞被膜对底物和产物跨膜运输的传质阻力,重组子BL21 (DE3)-pET28a-gadBC鍓的表观GAD催化活力较BL21 (DE3)-pET28a-gadB的提高了2.6倍。但实验过程中发现Glu-GABA反向转运蛋白的过量表达会对菌体生长产生严重的抑制效应,从而削弱了菌体表观GAD催化活力提高的正效应,表现为单位体积BL21 (DE3)-pET28a-gadBC发酵液中菌体的总表观GAD催化活力只比单位体积BL21(DE3)-pET28a-gadB发酵液的提高了1.39倍。3.采用有机溶剂、表面活性剂、细胞壁合成抑制剂、热处理和表达膜激肽(麦芽糖-蛙皮素融合蛋白)等多种细胞透性化方法来削弱BL21 (DE3)-pET28a-gadB细胞被膜对底物和产物跨膜运输的传质阻力,从而为其表观GAD催化活力的改善寻求了更为有效的方法。(1)采用有机溶剂对BL21(DE3)-pET28a-gadB进行透性化处理时,有机溶剂的疏水性与菌体表观GAD活力提高倍数呈现正相关,最有效的有机溶剂己烷在优化的处理条件下(1%己烷处理菌体5 min),可使菌体表观GAD活力提高9.65倍；(2)在所用的表面活性剂中,Triton X-100能最为有效地提高BL21(DE3)-pET28a-gadB的表观GAD催化活力,1% TritonX-100处理菌体5 min,可使菌体表观GAD活力提高10.8倍；(3)当用5μg/mL氨苄青霉素对BL21(DE3)-pET28a-gadB进行透性化处理时,菌体表观GAD催化活力可以提高6.42倍,但该方法会导致菌体生物量降低40.3%；(4)70℃条件下热处理BL21 (DE3)-pET28a-gadB菌体30 min,可使菌体表观GAD催化活力提高13.05倍,达到9.08 U/mmg(细胞干重),且没有出现GAD泄露现象；(5)表达麦芽糖-蛙皮素融合蛋白的透性化方法对BL21 (DE3)-pET28a-gadB的表观GAD催化活力没有明显改善效果。由于热处理可以最为有效的改善BL21 (DE3)-pET28a-gadB菌体的表观GAD催化活力,同时热处理不需要添加处理试剂,可以避免有毒物质的引入,且易于操作和放大,因此选择在70℃处理菌体30 mmin作为制备BL21 (DE3)-pET28a-gadB菌体催化剂的透性化处理方式。4.采用海藻酸钠-CaCl2法对经热处理制备的透性化BL21 (DE3)-pET28a-gadB菌体进行固定化,在菌体密度为9.28mg/mL、pH4.8、温度50℃、50mM CaCl2和0.1mM PLP的条件下,固定化细胞经过20批次共80 h反应后,其相对转化率能保持在最初的60%以上。将固定化细胞存放在4℃的无菌水中,其催化活力在一个月后仍能保持在90%以上。5.将固定化BL21 (DE3)-pET28a-gadB菌体催化的Glu脱羧反应与米根霉乳酸发酵进行耦合来同时制备GABA和乳酸,当耦合反应的pH控制在4.7-5.0之间时,GABA的产量可以达到44.8 g/L,且Glu到GABA的摩尔转化率为96.5%,乳酸的产量可以达到80.2 g/L,葡萄糖到乳酸的产率为67.0%。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：TQ226.36

【参考文献】