纳米材料作为药物及药物载体抑制阿尔兹海默症中Aβ聚集的研究

发布时间：2017-04-05 19:13

  本文关键词：纳米材料作为药物及药物载体抑制阿尔兹海默症中Aβ聚集的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：阿尔兹海默症(AD)是一种渐进的神经退行性疾病并且是老年性痴呆的最主要形式。AD的病理特征是大脑细胞外出现淀粉样斑块和细胞内出现神经原纤维缠结。淀粉样斑块主要由淀粉样前体蛋白(APP)经β-和γ-分泌酶酶解产生的42和40个氨基酸长的淀粉样β多肽(Aβ)组成。虽然AD发病的分子机制仍不清楚,但Aβ聚集是导致AD中神经退化的主导因素,这也是被公认的机制之一,而金属离子在Aβ的聚集及其神经毒性中发挥了重要作用。因此,Aβ聚集体及过量的金属离子是AD治疗的有效靶标。基于上述研究,本论文设计合成了四类纳米材料,系统地研究了纳米材料作为抑制剂或者药物载体在抑制Aβ纤维化聚集及其神经毒性中的作用,并深入探讨了纳米材料抑制Aβ聚集的作用机制。本研究分为以下五章:第一章,简要介绍了AD症状及病理特征、AD致病机理-淀粉样蛋白级联假说、Aβ聚集机理及其神经毒性,最后综述了纳米材料在抑制Aβ聚集中的研究进展。第二章,设计合成了可与Aβ40结合的L-半胱氨酸修饰的纳米硒(Se NPs)、纳米钌(Ru NPs)及复合硒/钌纳米粒子(Se/Ru NPs)作为Aβ40聚集的抑制剂。研究发现Ru NPs与Se/Ru NPs同Aβ多肽具有较强的亲和力并能有效抑制细胞外Aβ40自发聚集及Zn2+离子所诱导的聚集。Se/Ru NPs可抑制Zn2+-Aβ40聚集体所产生的活性氧(ROS)及其对PC12细胞的神经毒性。另一方面,Se/Ru NPs还可以不通过溶酶体途径减少细胞内Aβ40多肽的聚集。然而,Se NPs抑制金属离子所诱导Aβ多肽聚集的能力不如Se/Ru NPs。以上结果表明,钌可以提高Se/Ru NPs同Aβ40多肽的结合能力,而这种作用可以阻止Zn2+离子同Aβ40多肽的结合并导致游离的单体Aβ40减少,从而抑制Aβ40多肽聚集。第三章,将靶向结合Aβ的LPFFD多肽和靶向透过血脑屏障的TGN多肽修饰在纳米硒(Se NPs)表面,制备出双功能Se NPs。双功能Se NPs上LPFFD与TGN的最佳比例为1:1。我们深入研究了双功能Se NPs抑制Aβ聚集的作用机理。结果发现静电作用是单独Se NPs同Aβ40多肽结合的主要作用力,而LPFFD可增加双功能Se NPs同Aβ40多肽间的疏水作用力。因此,双功能Se NPs可通过阻止Aβ40多肽成核过程中疏水及静电作用,从而抑制Aβ40多肽的聚集并保护PC12免受Aβ40纤维的神经毒性。在透过血脑屏障(BBB)方面,TGN多肽可提高Se NPs穿过BBB的能力,而且双功能Se NPs透过BBB的能力优于单独的TGN多肽。综上,这些靶向多肽同Se NPs纳米粒子本身在抑制Aβ聚集及透过BBB方面具有协同作用。第四章,金属离子在AD的病理进程中起了重要作用,如促进Aβ聚集及H2O2的产生。虽然金属离子螯合剂可抑制金属离子所诱导Aβ聚集。然而,大部分金属离子螯合剂存在无法透过BBB及无法区分螯合Aβ斑块或者正常组织中的金属离子等缺点,这将导致一系列的副作用。为此我们设计合成对H2O2敏感的以纳米金(Au NPs)封堵介孔二氧化硅的控制释放系统(MSN-Au NPs),利用该控制释放系统靶向运送金属离子螯合剂CQ(MSN-CQ-Au NPs)。MSN-CQ-Au NPs只有在Aβ斑块中大量H2O2存在的情况下才能释放出CQ和Au NPs。Au NPs可以抑制Aβ40自发聚集,因此,MSN-CQ-Au NPs对Cu2+离子所诱导的Aβ40聚集的抑制作用优于MSN-CQ,并且能减少Aβ40-Cu2+聚集体所引起的PC12细胞膜破损、微管损伤及ROS诱导的细胞凋亡。在透过BBB方面,MSN本身能透过BBB,而表面修饰的Au NPs不影响MSN透过BBB能力。所合成的MSN-CQ-Au NPs具有较好透过BBB及精确控制释放CQ的能力。第五章,利用PEG-NH2修饰金属有机框架MIL-101(PEG@MIL-101)增加MIL-101的生物相容性及表面正电荷,发现PEG@MIL-101能在Aβ40多肽聚集的早期干扰其聚集,然而由于PEG@MIL-101同Aβ40纤维结合能力较弱导致其破坏Aβ40纤维结构的能力也随之减弱。因此,通过静电作用在纳米粒子表面修饰上负电荷Au NPs得到Au NPs@PEG@MIL-101,加入的Au NPs促进PEG@MIL-101同Aβ40纤维的结合并破坏纤维结构。细胞实验发现PEG@MIL-101及Au NPs@PEG@MIL-101可抑制Aβ40聚集体诱导的细胞凋亡、ROS产生、细胞膜破损、细胞内微管损伤以及减少PC12细胞对Aβ多肽的摄入,从而最终减少Aβ40聚集体的神经毒性。Au NPs@PEG@MIL-101同时还能通过破坏Aβ40纤维结构保护PC12细胞。
【关键词】：纳米材料 阿尔茨海默症 β淀粉样多肽 金属离子 抑制剂 药物载体
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R749.16;TB383.1
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 第一章绪论13-51
• 1.1 阿尔兹海默症概述13-14
• 1.2 阿尔兹海默症病理特征14-19
• 1.2.1 淀粉样蛋白斑15-16
• 1.2.2 神经纤维缠结16-19
• 1.3 AD致病机理-淀粉样蛋白级联假说19-21
• 1.4 Aβ 多肽21-28
• 1.4.1 Aβ 多肽的性质21-22
• 1.4.2 Aβ 多肽的聚集22-26
• 1.4.3 聚集Aβ 多肽的神经毒性26-28
• 1.4.4 轴突运输的损伤与AD28
• 1.5 现有的AD药物28-29
• 1.6 纳米材料作为Aβ 抑制剂的研究进展29-37
• 1.6.1 纳米材料作为Aβ 抑制剂31-35
• 1.6.2 纳米材料作为Aβ 抑制剂的载体35-37
• 参考文献37-51
• 第二章 Se/Ru复合纳米粒子作为阿尔兹海默症中金属离子所诱导Aβ 聚集的抑制剂的研究51-76
• 2.1 引言51-52
• 2.2 实验部分52-57
• 2.2.1 实验试剂及细胞培养52
• 2.2.2 溶液配制52-53
• 2.2.3 Se/Ru复合纳米粒子（Se/Ru NPs）与纳米钌（Ru NPs）的制备53
• 2.2.4 Se/Ru NPs与Ru NPs的表征53
• 2.2.5 Aβ_(40)聚集体的孵育53-54
• 2.2.6 纳米粒子同Aβ_(40)的结合54
• 2.2.7 Th T荧光实验54
• 2.2.8 圆二色谱（CD）实验54
• 2.2.9 原子力显微镜（AFM）54-55
• 2.2.10透射电镜（TFM）55
• 2.2.11细胞毒性检测55
• 2.2.12 TUNEL-DAPI染色55
• 2.2.13凋亡检测55-56
• 2.2.14细胞内活性氧（ROS）的检测56
• 2.2.15细胞内聚集Aβ_(40)的检测56
• 2.2.16 Aβ_(40)在细胞内的定位56
• 2.2.17统计方法56-57
• 2.3 结果和讨论57-71
• 2.3.1 Se NPs、Ru NPs和Se/Ru NPs的制备和表征57-60
• 2.3.2 Se NPs、Ru NPs和Se/Ru NPs同Aβ_(40)纤维的结合60-62
• 2.3.3 Se NPs、Ru NPs和Se/Ru NPs对Zn~(2+)离子所诱导的Aβ_(40)多肽聚集的影响62-64
• 2.3.4 Se NPs、Ru NPs和Se/Ru NPs对Zn~(2+)离子所诱导Aβ_(40)多肽聚集形态的影响64-66
• 2.3.5 Se NPs、Ru NPs和Se/Ru NPs对聚集Aβ_(40)多肽的神经毒性的影响66-67
• 2.3.6 Se/Ru NPs减少聚集Aβ_(40)多肽所导致的PC12细胞的凋亡67-68
• 2.3.7 Se/Ru NPs减少聚集Aβ_(40)多肽所诱导产生的ROS含量68-69
• 2.3.8 Se/Ru NPs抑制Aβ_(40)多肽在细胞内的聚集69-71
• 2.4 本章小结71-73
• 参考文献73-76
• 第三章双靶向多肽功能化纳米硒在阿尔兹海默症中治疗中的应用76-104
• 3.1 引言76-77
• 3.2 实验部分77-83
• 3.2.1 实验试剂及细胞培养77
• 3.2.2 溶液配制77-78
• 3.2.3 双功能Se NPs的制备78
• 3.2.4 CS-Se NPs、L1T2-Se NPs、L1T1-Se NPs和L2T1-Se NPs的表征78-79
• 3.2.5 Aβ 聚集体的孵育79
• 3.2.6 Th T荧光实验79
• 3.2.7 透射电镜（TFM）79-80
• 3.2.8 纳米粒子同Aβ_(40)多肽的结合80
• 3.2.9 细胞毒性检测80-81
• 3.2.10 H&E染色81
• 3.2.11 TUNEL-DAPI染色81
• 3.2.12凋亡检测81
• 3.2.13细胞内活性氧（ROS）的检测81-82
• 3.2.14 b End.3 细胞对纳米粒子的吸收82
• 3.2.15采用BBB模型检测纳米粒子透过BBB的能力82-83
• 3.2.16统计方法83
• 3.3 结果和讨论83-99
• 3.3.1 CS-Se NPs、L1T2-Se NPs、L1T1-Se NPs和L2T1-Se NPs的表征83-86
• 3.3.2 双功能Se NPs对Aβ_(40)多肽纤维化聚集的抑制作用86-89
• 3.3.3 双功能Se NPs与Aβ_(40)多肽的结合能力89-92
• 3.3.4 双功能Se NPs对Aβ_(40)多肽神经毒性的抑制作用92-93
• 3.3.5 双功能Se NPs对Aβ_(40)纤维所导致的PC12细胞形态变化的影响93-94
• 3.3.6 双功能Se NPs对Aβ_(40)纤维所导致的PC12细胞凋亡的抑制作用94-96
• 3.3.7 罗丹明B标记的L1T1-Se NPs和L2T1-Se NPs的细胞吸收96-97
• 3.3.8 BBB模型研究罗丹明B标记的L1T1-Se NPs透过BBB的能力97-99
• 3.4 本章小结99-100
• 参考文献100-104
• 第四章 对H_2O_2敏感的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统在阿尔兹海默症治疗中的应用104-131
• 4.1 引言104-105
• 4.2 实验部分105-110
• 4.2.1 实验试剂及细胞培养105
• 4.2.2 溶液配制105
• 4.2.3 MSN和MSN-Au NPs的制备105-106
• 4.2.4 MSN和MSN-Au NPs的表征106-107
• 4.2.5 药物体外释放107
• 4.2.6 b End.3 细胞对纳米粒子的吸收107
• 4.2.7 BBB模型研究纳米粒子透过血脑屏障107-108
• 4.2.8 Aβ 聚集体的制备108
• 4.2.9 Th T荧光实验108
• 4.2.10透射电镜（TEM）实验108
• 4.2.11细胞毒性检测108-109
• 4.2.12扫描电镜（SEM）实验109
• 4.2.13免疫细胞化学109
• 4.2.14 TUNEL-DAPI染色109-110
• 4.2.15细胞内活性氧（ROS）的检测110
• 4.2.16统计方法110
• 4.3 结果和讨论110-127
• 4.3.1 MSN和MSN-Au NPs的制备和表征110-114
• 4.3.2 H2O2调控药物在体外释放以及药物在细胞内的释放114-116
• 4.3.3 MSN及MSN-Au NPs透过血脑屏障的能力116-118
• 4.3.4 MSN-Au NPs及MSN-CQ-Au NPs对Aβ_(40)多肽聚集及其形态的影响118-121
• 4.3.5 MSN-CQ-Au NPs减少Aβ_(40)-Cu~(2+)复合物对神经细胞的毒性121-122
• 4.3.6 MSN-CQ-Au NPs减少Aβ_(40)-Cu~(2+)复合物对PC12细胞膜的损伤122-125
• 4.3.7 MSN-CQ-Au NPs减少Aβ_(40)-Cu~(2+)复合物对PC12细胞突触的损伤125
• 4.3.8 MSN-CQ-Au NPs减少Aβ_(40)-Cu~(2+)复合物所诱导PC12细胞的凋亡125-127
• 4.4 本章小结127-128
• 参考文献128-131
• 第五章 多孔金属有机框架作为Aβ 聚集抑制剂在阿尔兹海默症中治疗中的应用131-156
• 5.1 引言131-132
• 5.2 实验部分132-137
• 5.2.1 实验试剂及细胞培养132
• 5.2.2 溶液配制132-133
• 5.2.3 PEG@MIL-101与Au NPs@PEG@MIL-101的制备133
• 5.2.4 PEG@MIL-101与Au NPs@PEG@MIL-101的表征133-134
• 5.2.5 药物体外负载与释放134
• 5.2.6 Aβ_(40)聚集体的孵育134-135
• 5.2.7 Th T荧光实验135
• 5.2.8 透射电镜（TEM）135
• 5.2.9 细胞毒性检测135-136
• 5.2.10原子力显微镜（AFM）实验136
• 5.2.11 TUNEL-DAPI染色136
• 5.2.12细胞内活性氧（ROS）的检测136
• 5.2.13细胞骨架染色136-137
• 5.2.14 Aβ_(40)多肽进入细胞的情况137
• 5.2.15统计方法137
• 5.3 结果和讨论137-152
• 5.3.1 PEG@MIL-101与Au NPs@PEG@MIL-101的制备和表征137-140
• 5.3.2 PEG@MIL-101与Au NPs@PEG@MIL-101对Aβ_(40)聚集及其形态的影响140-143
• 5.3.3 PEG@MIL-101与Au NPs@PEG@MIL-101对Aβ_(40)神经毒性的抑制作用143-144
• 5.3.4 PEG@MIL-101与Au NPs@PEG@MIL-101对Aβ_(40)纤维诱导PC12细胞凋亡的抑制作用144-146
• 5.3.5 PEG@MIL-101与Au NPs@PEG@MIL-101减少Aβ_(40)纤维诱导ROS的含量146-147
• 5.3.6 PEG@MIL-101与Au NPs@PEG@MIL-101对Aβ_(40)纤维诱导PC12细胞膜变化的影响147-148
• 5.3.7 PEG@MIL-101与Au NPs@PEG@MIL-101减少Aβ_(40)纤维对PC12细胞轴突的损伤148-149
• 5.3.8 PEG@MIL-101与Au NPs@PEG@MIL-101减少细胞摄入Aβ_(40)多肽149-150
• 5.3.9 PEG@MIL-101与Au NPs@PEG@MIL-101负载药物在体外释放150-151
• 5.3.10 PEG@MIL-101作为药物载体负载姜黄素对PC12细胞骨架损伤的影响151-152
• 5.4 本章小结152-153
• 参考文献153-156
• 博士期间发表的论文156-158
• 致谢158

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