大豆致敏蛋白glycinin和β-conglycinin免疫学快速检测技术研究

发布时间：2017-04-05 22:12

  本文关键词：大豆致敏蛋白glycinin和β-conglycinin免疫学快速检测技术研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：食物过敏是一种重要的过敏病症,是机体暴露于某种食物或食物成分时由特定免疫应答引起的可重复发生的不良反应。食物过敏能够导致不同程度的机体损伤,包括消化系统、呼吸系统、循环系统和皮肤的损伤,甚至可以导致致命的过敏性休克。因此,食物过敏被视为影响公众营养卫生的食品安全问题之一。随着人们对食物过敏问题的日益重视,针对食物过敏原的快速、准确的检测方法得到了发展,其中免疫学方法具有灵敏性高、特异性强的特点,能够进行定性、定量检测而成为研究热点。作为一种重要的粮食作物,大豆应用广泛,并在人类和动物营养方面起着至关重要的作用,但大豆也是八种主要致敏性食物之一,含有多种致敏蛋白,容易引发婴幼儿及幼龄动物出现过敏反应。本研究以大豆中的两种主要致敏蛋白glycinin和β-conglycinin为研究对象,在制备免疫学特性良好的兔源多克隆抗体(Polyclonal antibody,p Ab)和鼠源单克隆抗体(Monoclonal antibody,m Ab)的基础之上,研制出分别用于glycinin和β-conglycinin快速检测的双抗体夹心ELISA试剂盒和胶体金免疫层析试纸。一方面可以应用于食品标签上大豆致敏成分标注信息的快速准确监管,进一步提高大豆过敏消费者的食品安全;另一方面可以作为研究大豆致敏蛋白脱敏方法的有效工具,用于鉴定脱敏方法的可行性与有效性。本研究的主要研究结果如下:(1)利用等电点沉淀法从脱脂大豆粉中分离纯化glycinin和β-conglycinin,将glycinin和β-conglycinin分别免疫新西兰大白兔,采用颈部皮下多点注射,四次免疫之后进行心脏采血并分离血清。利用饱和硫酸铵沉淀法纯化制备glycinin兔源p Ab和β-conglycinin兔源p Ab,经ELISA方法鉴定,效价分别为1:1.024×106和1:5.12×105,并且具有良好的敏感性和较强的特异性。(2)将glycinin和β-conglycinin分别免疫6~8周龄的BALB/c小鼠,选择多克隆抗血清效价高、敏感性好的小鼠,应用细胞融合技术建立杂交瘤细胞系,经过对阳性杂交瘤的筛选,获得1株稳定分泌glycinin m Ab的杂交瘤细胞株2C3和3株稳定分泌β-conglycinin m Ab的杂交瘤细胞株1G6、7E7、8C11。通过小鼠体内诱生腹水法制备m Ab,这4株m Ab的亚型均为Ig G1型,间接ELISA测定效价分别为1:5.12×105、1:2.56×105、1:1.024×106和1:5.12×105;间接竞争ELISA测定半数抑制浓度分别为498.7 ng/m L,844.2 ng/m L、479.4 ng/m L和889.6 ng/m L;ELISA饱和法测定亲和常数分别为4.27×109 L/mol、3.29×108 L/mol、1.34×109 L/mol和3.48×108 L/mol。交叉反应试验和免疫印迹试验表明4株m Ab均具有很强的特异性。(3)基于制备的兔源p Ab和鼠源m Ab,利用双抗体夹心模式建立glycinin和β-conglycinin的ELISA检测方法。应用2C3 m Ab和glycinin兔源p Ab研制出glycinin双抗体夹心ELISA检测试剂盒,检测限为16.3 ng/m L,线性检测范围为15.625~2000 ng/m L,奶粉样品的平均添加回收率为80.5%~88.9%,变异系数小于15%;应用7E7 m Ab和β-conglycinin兔源p Ab研制出β-conglycinin双抗体夹心ELISA检测试剂盒,检测限为15.4 ng/m L,线性检测范围为15.625~2000 ng/m L,奶粉样品的平均添加回收率为83.4%~90.9%,变异系数小于15%。两种试剂盒与其他常见食物致敏蛋白无交叉反应,特异性良好,且具有很好的稳定性,能够在4℃条件下避光保存至少3个月。(4)基于胶体金免疫层析技术,利用制备的兔源p Ab和鼠源m Ab,首次成功研制出分别用于glycinin和β-conglycinin快速检测的胶体金免疫层析试纸。Glycinin试纸的目测和机读检测限分别为100 ng/m L和46.1 ng/m L;β-conglycinin试纸的目测和机读检测限分别为200 ng/m L和152.8 ng/m L。两种试纸的奶粉样品平均添加回收率和变异系数均在正常范围内,与其他常见食物致敏蛋白无交叉反应,特异性强,且重复性和稳定性良好,可以常温密封干燥保存至少3个月。
【关键词】：大豆致敏蛋白 多克隆抗体 单克隆抗体 双抗体夹心ELISA 胶体金免疫层析试纸
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS207.3
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-17
• 第一章 文献综述17-34
• 1.1 食物过敏概述17-24
• 1.1.1 超敏反应的分类及特点17-18
• 1.1.2 食物过敏反应及其机制18-19
• 1.1.3 食物过敏原19-21
• 1.1.3.1 主要的动物性食物过敏原20
• 1.1.3.2 主要的植物性食物过敏原20-21
• 1.1.3.3 转基因食品以及食品添加剂21
• 1.1.4 国内外食物过敏现状21-22
• 1.1.5 国内外食物过敏安全管理及致敏标识现状22-24
• 1.2 大豆致敏蛋白的种类及危害24-27
• 1.2.1 Glycinin25-26
• 1.2.2 β-conglycinin26
• 1.2.3 大豆致敏蛋白的危害26-27
• 1.3 大豆致敏蛋白检测技术研究进展27-31
• 1.3.1 色谱和质谱分析法28
• 1.3.2 聚合酶链式反应法28-29
• 1.3.3 免疫印迹试验29
• 1.3.4 放射或酶联过敏原吸附抑制试验29-30
• 1.3.5 酶联免疫吸附试验30-31
• 1.4 本研究的目的及意义31-32
• 1.5 本研究的主要内容和技术路线32-34
• 1.5.1 本研究的主要内容32-33
• 1.5.2 本研究的技术路线33-34
• 第二章 Glycinin和 β-conglycinin兔源多克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定34-46
• 2.1 材料和仪器34-36
• 2.1.1 试剂34-35
• 2.1.2 溶液35-36
• 2.1.3 实验动物36
• 2.1.4 仪器设备36
• 2.2 方法36-40
• 2.2.1 等电点沉淀法分离glycinin和 β-conglycinin36-37
• 2.2.2 Glycinin和 β-conglycinin的纯度分析37
• 2.2.3 Glycinin和 β-conglycinin兔源p Ab的制备37-38
• 2.2.3.1 动物免疫程序37-38
• 2.2.3.2 动物采血方法38
• 2.2.3.3 兔源p Ab的纯化38
• 2.2.4 Glycinin和 β-conglycinin兔源p Ab的免疫学特性鉴定38-40
• 2.2.4.1 间接ELISA测定兔源p Ab效价39
• 2.2.4.2 间接竞争ELISA鉴定兔源p Ab敏感性39
• 2.2.4.3 兔源p Ab特异性鉴定39-40
• 2.3 结果与分析40-43
• 2.3.1 Glycinin和 β-conglycinin的分离与纯度分析40
• 2.3.2 Glycinin和 β-conglycinin兔源p Ab效价40-41
• 2.3.3 Glycinin和 β-conglycinin兔源p Ab敏感性41-42
• 2.3.4 Glycinin和 β-conglycinin兔源p Ab特异性42-43
• 2.4 讨论43-45
• 2.4.1 关于glycinin和 β-conglycinin分离与鉴定43-44
• 2.4.2 关于免疫原的制备以及免疫方式的选择44
• 2.4.3 关于glycinin和 β-conglycinin兔源p Ab的免疫学特性鉴定44-45
• 2.5 小结45-46
• 第三章 Glycinin和 β-conglycinin鼠源单克隆抗体的制备及其免疫学特性鉴定46-69
• 3.1 材料和仪器46-48
• 3.1.1 试剂46-47
• 3.1.2 溶液47-48
• 3.1.3 实验动物与骨髓瘤细胞48
• 3.1.4 仪器设备48
• 3.2 方法48-54
• 3.2.1 Glycinin和 β-conglycinin鼠源多克隆抗血清的制备48-49
• 3.2.2 Glycinin和 β-conglycinin鼠源多克隆抗血清的免疫学特性鉴定49
• 3.2.2.1 多克隆抗血清的效价测定49
• 3.2.2.2 多克隆抗血清的敏感性鉴定49
• 3.2.3 Glycinin和 β-conglycinin鼠源m Ab杂交瘤细胞株的建立49-52
• 3.2.3.1 细胞融合所用小鼠的选择与超免49-50
• 3.2.3.2 小鼠NS0骨髓瘤细胞的培养50
• 3.2.3.3 小鼠脾细胞的分离50
• 3.2.3.4 细胞融合过程及细胞培养50-51
• 3.2.3.5 饲养细胞（腹腔巨噬细胞）的制备51
• 3.2.3.6 杂交瘤细胞阳性孔的筛选和克隆51-52
• 3.2.4 Glycinin和 β-conglycinin鼠源m Ab的大量制备52
• 3.2.5 Glycinin和 β-conglycinin鼠源m Ab的免疫学特性鉴定52-54
• 3.2.5.1 亚型鉴定52-53
• 3.2.5.2 效价测定53
• 3.2.5.3 敏感性鉴定53
• 3.2.5.4 亲和常数测定53
• 3.2.5.5 特异性鉴定53-54
• 3.3 结果与分析54-65
• 3.3.1 Glycinin和 β-conglycinin鼠源多抗血清效价测定54-55
• 3.3.2 Glycinin和 β-conglycinin鼠源多克隆抗血清敏感性鉴定55-56
• 3.3.3 Glycinin和 β-conglycinin鼠源m Ab杂交瘤细胞株的建立56-58
• 3.3.4 Glycinin鼠源m Ab的免疫学特性鉴定58-61
• 3.3.4.1 Glycinin鼠源m Ab亚型58-59
• 3.3.4.2 Glycinin鼠源m Ab效价59
• 3.3.4.3 Glycinin鼠源m Ab敏感性59-60
• 3.3.4.4 Glycinin鼠源m Ab亲和常数60
• 3.3.4.5 Glycinin鼠源m Ab特异性60-61
• 3.3.5 β-conglycinin鼠源m Ab的免疫学特性鉴定61-65
• 3.3.5.1 β-conglycinin鼠源m Ab的亚型61-62
• 3.3.5.2 β-conglycinin鼠源m Ab效价62
• 3.3.5.3 β-conglycinin鼠源m Ab敏感性62-63
• 3.3.5.4 β-conglycinin鼠源m Ab亲和常数63-64
• 3.3.5.5 β-conglycinin鼠源m Ab特异性64-65
• 3.4 讨论65-68
• 3.4.1 关于BALB/c小鼠的免疫及融合前超免65-66
• 3.4.2 关于细胞融合过程及阳性杂交瘤细胞筛选66-67
• 3.4.3 关于glycinin和 β-conglycinin鼠源m Ab的大量制备67
• 3.4.4 关于glycinin和 β-conglycinin鼠源m Ab的免疫学特性鉴定67-68
• 3.5 小结68-69
• 第四章 双抗体夹心ELISA检测试剂盒的研制及其特性鉴定69-83
• 4.1 材料和仪器69-70
• 4.1.1 试剂69
• 4.1.2 溶液69-70
• 4.1.3 仪器设备70
• 4.2 方法70-72
• 4.2.1 Glycinin和 β-conglycinin双抗体夹心ELISA检测方法的建立70-71
• 4.2.1.1 双抗体夹心ELISA检测方法基本操作步骤70
• 4.2.1.2 捕获抗体包被浓度以及检测抗体工作浓度的优化70-71
• 4.2.1.3 样品与捕获抗体反应时间的优化71
• 4.2.2 双抗体夹心ELISA检测试剂盒的装配71
• 4.2.3 双抗体夹心ELISA检测试剂盒标准曲线的绘制与结果判定71
• 4.2.4 双抗体夹心ELISA检测试剂盒的特性鉴定71-72
• 4.2.4.1 检测限鉴定71-72
• 4.2.4.2 准确度和精密度鉴定72
• 4.2.4.3 特异性鉴定72
• 4.2.4.4 稳定性鉴定72
• 4.3 结果与分析72-78
• 4.3.1 双抗体夹心ELISA检测方法的建立72-74
• 4.3.1.1 捕获抗体包被浓度以及检测抗体工作浓度的确定72-73
• 4.3.1.2 样品与捕获抗体的反应时间73-74
• 4.3.2 双抗体夹心ELISA检测试剂盒的检测流程74-75
• 4.3.3 双抗体夹心ELISA检测试剂盒的标准曲线75
• 4.3.4 双抗体夹心ELISA检测试剂盒的特性鉴定结果75-78
• 4.3.4.1 检测限75-76
• 4.3.4.2 准确度和精密度76-77
• 4.3.4.3 特异性77-78
• 4.3.4.4 稳定性78
• 4.4 讨论78-81
• 4.4.1 关于ELISA检测试剂盒的模式选择78-79
• 4.4.2 关于捕获抗体和检测抗体的选择和优化79-80
• 4.4.3 关于试剂盒的显色系统80-81
• 4.4.4 关于试剂盒的特性鉴定81
• 4.5 小结81-83
• 第五章 胶体金免疫层析快速检测试纸的研制及其特性鉴定83-103
• 5.1 材料和仪器83-85
• 5.1.1 试剂材料83-84
• 5.1.2 溶液84
• 5.1.3 仪器设备84-85
• 5.2 方法85-90
• 5.2.1 胶体金纳米颗粒的制备85
• 5.2.2 胶体金纳米颗粒的特性鉴定85-86
• 5.2.2.1 裸眼观察85
• 5.2.2.2 分光光度法85
• 5.2.2.3 透射电镜扫描法85-86
• 5.2.3 胶体金标记m Ab的制备86
• 5.2.3.1 待标记m Ab的前处理86
• 5.2.3.2 待标记m Ab最佳标记量的确定86
• 5.2.3.3 胶体金标记m Ab86
• 5.2.4 结合垫的制备86-87
• 5.2.5 样品垫与吸水垫的制备87
• 5.2.6 NC膜的制备87
• 5.2.7 胶体金免疫层析试纸的装配87-88
• 5.2.8 胶体金免疫层析试纸的检测原理88
• 5.2.9 胶体金免疫层析试纸检测方法的建立88-89
• 5.2.9.1 目测半定量检测方法88-89
• 5.2.9.2 读条仪机读定量检测方法89
• 5.2.10胶体金免疫层析试纸的性能鉴定89-90
• 5.2.10.1 检测限鉴定89
• 5.2.10.2 准确度鉴定89-90
• 5.2.10.3 特异性鉴定90
• 5.2.10.4 重复性和稳定性鉴定90
• 5.3 结果与分析90-98
• 5.3.1 胶体金纳米颗粒的特性90-91
• 5.3.2 待标记m Ab的最佳标记量91-92
• 5.3.3 胶体金免疫层析试纸性能鉴定结果92-98
• 5.3.3.1 目测半定量检测限92-93
• 5.3.3.2 机读定量检测限93-96
• 5.3.3.3 准确度96-97
• 5.3.3.4 特异性97
• 5.3.3.5 重复性和稳定性97-98
• 5.4 讨论98-102
• 5.4.1 关于制备胶体金纳米颗粒的注意事项98-99
• 5.4.2 关于胶体金纳米颗粒的粒径大小99-100
• 5.4.3 关于胶体金纳米颗粒标记m Ab的制备100
• 5.4.4 关于NC膜的选择100-101
• 5.4.5 关于试纸检测原理及其检测模式选择101
• 5.4.6 关于试纸的特性鉴定101-102
• 5.5 小结102-103
• 第六章 结论、创新点及展望103-105
• 6.1 研究结论103
• 6.2 创新点103-104
• 6.3 展望104-105
• 参考文献105-114
• 缩略词114-117
• 致谢117-119
• 作者简介119-120

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  本文关键词：大豆致敏蛋白glycinin和β-conglycinin免疫学快速检测技术研究，，由笔耕文化传播整理发布。

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