混合模式介质的蛋白吸附性能和免疫球蛋白G分离研究

发布时间：2020-11-19 00:30

　　 混合模式层析(Mixed-mode chromatography, MMC)是一种新型的生物分离方法,其配基兼有疏水、静电、氢键等多种相互作用,具有吸附容量高、选择性好、洗脱条件温和等特点,已取得较好的应用。本文以对氨基马尿酸为配基的商业化混合模式介质Nuvia cPrime为参照,在课题组前期研究基础上,选取聚丙烯酸甲酯微球为基质,偶联5-氨基苯并咪唑(ABI)制得新型混合模式介质KB-ABI,以免疫球蛋白和血清白蛋白为模型蛋白,系统考察了两种混合模式介质的蛋白吸附性能,探讨了模拟血清和单克隆抗体分离,并借助共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscopy, CLSM)对蛋白传质和吸附过程进行了分析。主要结果如下：(1)以牛免疫球蛋白G (bIgG)和牛血清白蛋白(BSA)为模型蛋白,考察了Nuvia cPrime介质的静态吸附、柱吸附和洗脱行为。结果表明,pH和盐浓度对两种蛋白的吸附具有不同影响,在pH 6.0时两种蛋白的吸附量出现最大差异,吸附量随NaCl浓度升高而降低,随(NH4)2SO4浓度升高出现“U”型变化。调节pH和盐浓度可以提高Nuvia cPrime对bIgG和BSA的分离选择性,以pH 6.0、0.8 M (NH4)2SO4上样吸附,pH8.0、1.0MNaCl洗脱,可实现bIgG和BSA的有效分离。(2)以人免疫球蛋白G (hIgG)和BSA为模型蛋白,考察不同比例混合后在Nuvia cPrime介质上的共吸附行为。发现两种蛋白存在一定的竞争性关系,hIgG占据明显的主导地位,pH 6.0时最为明显,固相和液相中hIgG/BSA的摩尔比差别高达10倍。采用单组分吸附等温线的拟合参数,分别用Extended Langmuir (EL)和Extended Langmuir-Freundlich (ELF)吸附模型对双组分蛋白的共吸附行为进行了预测,计算值与实验值吻合较好。(3)以聚丙烯酸甲酯微球为基质,ABI为功能配基,制得新型混合模式介质KB-ABI,配基密度高达195 μ/mL。考察了hIgG和BSA的静态吸附,发现具有较强的pH依赖性和耐盐吸附特性,hIgG吸附容量在pH 8.0时达到最大,BSA吸附容量随pH升高而逐渐下降。考察了双组分蛋白的共吸附行为,表明两种蛋白吸附存在竞争性,pH 5.0和8.0时表现突出,并采用EL和ELF模型对共吸附行为进行了分析,计算结果偏差较小。考察了两种蛋白的柱吸附行为,以pH8.0、0.2MNaCl平衡上样,pH 5.0缓冲液洗脱,可以分离hIgG和BSA。(4)考察了Nuvia cPrime和KB-ABI两种介质对hIgG和BSA单组分和双组分蛋白的吸附动力学行为。发现两种蛋白存在一定的竞争吸附关系,40 min时BSA吸附出现明显的峰值,随后逐步下降,说明hIgG对BSA的竞争取代作用。采用吸附动力学模型对单、双组分的吸附动力学曲线进行了拟合,得到表面扩散系数Ds,发现pH改变对hIgG的Ds影响很小,而BSA在两种介质中呈现不同的变化规律。(5)以模拟血清(IgG:BSA=1:4)和CHO细胞培养上清液为料液,以IgG纯度和收率、宿主细胞蛋白(HCP)去除效果等为指标,比较Nuvia cPrime和KB-ABI两种介质的抗体分离性能。对于Nuvia cPrime,模拟血清分离IgG的纯度和收率分别为99.8%和92.7%,CHO培养液中mAb分离纯度和收率分别为92.8%和82.5%。对于KB-ABI,模拟血清分离IgG的纯度和收率分别达99.7%和94.6%,CHO培养液中mAb分离纯度达到94.9%,收率92.5%。对于HCP去除,KB-ABI的效果与ProteinA亲和层析相当,明显优于Nuvia cPrim,显示出良好的应用前景。(6)采用CLSM分析蛋白质的传质和吸附过程,探讨Nuvia cPrime和KB-ABI介质的吸附分离机制。验证了荧光标记对蛋白吸附影响较小,考察了不同pH下单组分hIgG和BSA的吸附行为,发现两种蛋白都表现出孔扩散和表面扩散相结合的传质机制,并实现了荧光强度和宏观吸附容量的定量关联。进一步采用双荧光标记,考察了双组分蛋白的吸附行为,分析了两种蛋白的竞争性取代机制,并探讨了Overshoot现象的形成机理。最后考察了蛋白质的解吸和顺序吸附,发现介质表面与蛋白具有较强的结合力,两种介质的吸附过程存在一定的差异。本文围绕两种新型MMC介质,从蛋白吸附性能出发,探讨pH和添加盐影响,分析不同蛋白的吸附差异,优化抗体分离工艺,并利用CLSM探讨不同介质的传质分离机制,相关结果将有助于促进MMC的抗体分离应用。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：O629.73
【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
符号表
缩略语表
第一章 文献综述
    1.1 引言
    1.2 生物分离过程中的层析技术
        1.2.1 离子交换层析
        1.2.2 亲和层析
        1.2.3 疏水相互作用层析
        1.2.4 凝胶过滤层析
    1.3 混合模式层析
        1.3.1 混合模式层析原理
        1.3.2 混合模式层析的种类
        1.3.3 混合模式功能配基
        1.3.4 混合模式层析的应用
    1.4 多组分蛋白吸附
        1.4.1 多组分吸附平衡模型
        1.4.2 多组分蛋白质吸附的研究进展
    1.5 层析介质内的蛋白传质行为研究
        1.5.1 宏观方法
        1.5.2 微观方法
    1.6 共聚焦激光扫描显微镜技术
        1.6.1 简介
        1.6.2 工作原理
        1.6.3 CLSM的应用
        1.6.4 CLSM用于蛋白吸附研究的局限性
    1.7 本论文的研究思路
第二章 Nuvia cPrime介质的蛋白吸附性能
    2.1 引言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 仪器与试剂
        2.2.2 吸附等温线测定
        2.2.3 层析柱中吸附行为
        2.2.4 层析柱中解吸行为
        2.2.5 Zeta电位测定
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 蛋白的Zeta电位
        2.3.2 pH对bIgG和BSA静态吸附的影响
        2.3.3 盐浓度对bIgG和BSA静态吸附的影响
        2.3.4 层析柱中吸附行为
        2.3.5 层析柱中洗脱行为
    2.4 本章小结
第三章 Nuvia cPrime介质对混合蛋白的吸附性能
    3.1 引言
    3.2 吸附理论模型
        3.2.1 单组分静态吸附模型
        3.2.2 双组分竞争性吸附模型
        3.2.3 双组分吸附的预测
        3.2.4 误差分析
        3.2.5 吸附动力学模型
    3.3 材料与方法
        3.3.1 试剂与仪器
        3.3.2 蛋白质定量分析
        3.3.3 吸附等温线测定
        3.3.4 吸附动力学曲线测定
        3.3.5 Zeta电位测定
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 蛋白的Zeta电位
        3.4.2 混合蛋白浓度的定量分析
        3.4.3 单一组分吸附
        3.4.4 双组分吸附
        3.4.5 单一和混合蛋白的吸附动力学
    3.5 本章小结
第四章 混合模式介质KB-ABI制备及蛋白吸附性能
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 试剂与仪器
        4.2.2 介质制备
        4.2.3 活化密度测定
        4.2.4 配基密度测定
        4.2.5 吸附等温线测定
        4.2.6 吸附动力学曲线测定
        4.2.7 层析柱中吸附行为
        4.2.8 蛋白质定量分析
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 KB-ABI介质制备
        4.3.2 单组分蛋白的静态吸附
        4.3.3 双组分蛋白的静态吸附
        4.3.4 吸附动力学曲线
        4.3.5 柱吸附行为
    4.4 本章小结
第五章 混合模式层析分离免疫球蛋白G和抗体
    5.1 引言
    5.2 材料与方法
        5.2.1 试剂与仪器
        5.2.2 IgG/BSA混合蛋白中分离IgG
        5.2.3 CHO细胞培养液中分离mAb
        5.2.4 Protein A亲和层析
        5.2.5 蛋白定量分析
        5.2.6 蛋白电泳分析
        5.2.7 CHO宿主细胞蛋白测定
    5.3 结果与讨论
        5.3.1 Nuvia cPrime介质层析分离性能
        5.3.2 KB-ABI介质的层析分离性能
        5.3.3 CHO宿主细胞蛋白分析
    5.4 本章小结
第六章 介质内蛋白质吸附过程的CLSM分析
    6.1 引言
    6.2 材料及方法
        6.2.1 试剂与仪器
        6.2.2 蛋白质的荧光标记
        6.2.3 荧光蛋白的分离纯化
        6.2.4 标记蛋白的吸附
        6.2.5 标记蛋白的解吸
        6.2.6 蛋白的次序吸附
        6.2.7 CLSM观测
    6.3 结果与讨论
        6.3.1 荧光标记对蛋白吸附行的影响
        6.3.2 Nuvia cPrime介质吸附的CLSM分析
        6.3.3 KB-ABI介质吸附的CLSM分析
        6.3.4 CLSM分析和宏观吸附的关联
        6.3.5 蛋白解吸的CLSM分析
        6.3.6 蛋白顺序吸附的CLSM分析
    6.4 本章小结
第七章 结论与展望
    7.1 结论
    7.2 建议与展望
参考文献
攻读博士学位期间的研究成果
作者简介

【参考文献】

相关期刊论文 前5条

1 魏琪,姚汝华,鲍时翔;两种固定化金属螯合复合亲和膜色谱介质制备[J];功能高分子学报;2000年01期

2 陈振明;林东强;姚善泾;;新型混合模式层析介质制备及用于牛初乳免疫球蛋白分离[J];化工学报;2012年08期

3 陈勇,徐燚,应汉杰,欧阳平凯;亲和层析研究进展[J];离子交换与吸附;2001年03期

4 石智聪;史清洪;孙彦;;离子交换介质内蛋白置换行为的观测与解析[J];化工学报;2013年01期

5 吴淑江;祝骥;李敏;易喻;梅建凤;朱克寅;应国清;;蛋白A亲和层析法纯化抗乙肝核心抗原单克隆抗体[J];药物生物技术;2010年01期

相关博士学位论文 前3条

1 周笑鹏;蛋白质吸附平衡和动力学理论研究[D];天津大学;2006年

2 杨坤;蛋白质离子交换色谱的吸附传质动力学研究[D];天津大学;2007年

3 夏海锋;纤维素基复合层析基质的功能化与应用基础研究[D];浙江大学;2008年

相关硕士学位论文 前1条

1 石智聪;共聚焦扫描显微镜辅助离子交换置换色谱动力学的研究[D];天津大学;2012年

本文编号：2889429