凝血酶适配体的单分子磁镊研究
发布时间：2020-12-24 07:40
凝血酶适配体HD1可以控制凝血酶的活性,调控凝血过程,因有望成为生物无毒的抗栓核酸药物而被广泛关注。在凝血酶适配体HD1基础上,产生的重复序列HD1凝血酶适配体和二价凝血酶适配体（HD1序列与HD22序列串联）,有望进一步增强结合效率和拓展应用领域。从单分子水平上对这些凝血酶适配体的行为进行研究,有利于揭示它们的作用机制,为更好的设计核酸药物或传感器提供理论依据。基于磁镊的单分子力谱技术在微小力控制方面具有超强的稳定性,为在长时间尺度下操控和研究核酸与蛋白质的相互作用提供了有力的工具。本论文在第一章中,详细地介绍了磁镊单分子力谱技术,包括磁镊的构造及原理、工作过程和数据的获得与分析、单分子拉伸的获得与判断标准、磁镊力值校正方法。在接下来的章节中以磁镊单分子力谱为主要表征手段,以研究单个凝血酶适配体及其衍生物的高级结构、力学稳定性、折叠动力学和各结构单元的协同工作机制等为目标,开展了以下四方面的工作。在本论文第二章中,利用共价偶联和双指数函数力值校正等方法,构建了基于磁镊的单分子操纵及测量系统,为本论文的研究工作奠定了基础。本章以2700bp双链DNA和八聚GB1蛋白为模型体系,对共价偶...
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：143 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
AFM工作原理的示意图(Bruker Nano Inc.,)。
力学探测系统是原子力显微镜力谱探测或者成像的重要核心系统,由微悬臂(Micro Cantilever)与坐落于微悬臂的尖端的针尖(Tip)组成,如图1.2所示,微悬臂是通常有长条状的矩形和等腰三角形两种形状,当然也有特殊定制的L型等等形状,其材质一般为氮化硅,二氧化硅或硅基等等。有些微悬臂的悬臂背部会被镀上金属材质的涂层,从而可以提高硅基材对光的反射效率,能够提高激光反射的信号检测灵敏度。由于原子力显微镜技术是通过针尖与基底上样品的相互作用的反馈而产生形貌的,这种相互作用可以达到极小的力值,例如达到皮牛顿级别,甚至可以通过远程的相互作用不接触到样品就能够对样品成像,其力学探测系统核心的灵敏检测限受到周围环境温度湿度等等、系统稳定性比如光电噪音等等的影响。为了能够驱动探针的运动,后方的微悬臂必须具有足够的动力能够带动针尖的运动。通过改变微悬臂的形状和材料等等方法,微悬臂能够提供合适的弹性系数,弹性系数小会使探针变软故能够提高力学探测系统的灵敏度,故检测下限能够向下拓展。原子力显微镜的光学检测系统主要由四个器件构成:它们分别是:1.四象限光电检测器(Position Sensitive);2.反射镜(Mirror);3.棱镜(Lens);4.激光二极管(Laser Diode)。激光二极管会发出一束非常集中的激光束,这束激光通过反射棱镜的反射,能够照射到微悬臂的尖端背部,随后在微悬臂的尖端背部再被反射出去。通过将这速反射出来的激光打四象限光电检测器上,就能够通过反射的原理扩大微悬臂的偏转,微悬臂的偏转在光电检测器能够放大将近一千倍,如1997年Hansma等人在杂志《International Journal of Imaging Systems and Technology》发表的报道,他们使用原子力显微镜,测算到四象限光电检测器上3-10 nm的位移只对应着微悬臂0.01 nm的偏转[55]。这样在使用原子力显微镜对非常微小的物体成像时,微小物体的形貌起伏会使得正在扫描的探针发生偏转,从而使从微悬臂背面反射到四象限的激光束的位置发生变化,通过电脑将各种偏转的方向和程度记录下来,最终根据电脑的计算和成处微小物体的形貌。
从磁场上分类可以分为磁镊(magnetic tweezers)、自由旋转磁镊(freely orbiting magnetic tweezers)、力矩磁镊(magnetic torque tweezers)。传统磁镊应用两块条形永磁铁产生磁场,如图1.4A给出了传统磁镊的示意图,并列的条形磁铁所提供给磁球的外磁场是沿着水平方向的。内部连接了“磁球-DNA”的样品池放置于高倍物镜上,磁铁放置在样品池的另一侧,对磁球施加磁力,进行单分子力学操纵。2011年,荷兰代尔夫特理工大学的Nynke Dekker课题组开发了自由旋转磁镊,他们将条形磁铁换为轴向充磁的环形磁铁,如图1.4B所示。这时候,施加在磁球上的磁场变成了沿竖直方向。磁感线由下而上,越往上越密集,磁场梯度依然存在,磁球仍然受到向上的力,然而由于磁场线沿竖直方向,磁球在水平方向不再受外来磁矩限制,可以自由转动。因为小球下方生物大分子的连接位点几乎不可能是在严格的正下方,在显微镜中可以看到小球以某一个点为圆心,在一个环状区域内自由转动。这个转动对应的正是下方所连分子自身的转到。自由旋转磁镊可以观察分子的转动却不能添加外加转矩。图1.4C是力矩磁镊。在自由旋转磁镊的环状磁铁外部加一个很小的磁铁,这样磁球会受到来自外界的一个很小的磁矩。转动磁铁,磁球随之转动但并不是完全同步。另外,从磁铁性质上分类可以分为永磁铁磁镊和电磁铁磁镊。永磁铁能够在不施加外界干扰的条件下提供较强的磁力。而电磁铁由于发热等外因影响,有时会对体系产生一定影响。但电磁铁的磁力和磁场控制更为精确便捷。
【参考文献】：
期刊论文
[1]单分子水平高分子相互作用的AFM成像与单分子力谱研究[J]. 张文科. 高分子学报. 2011(09)
[2]凝血酶的结构及其变构特性[J]. 许善峰,李芳,姜涌明,杨生妹. 中国医学生物技术应用. 2004(03)
本文编号：2935263
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：143 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
AFM工作原理的示意图(Bruker Nano Inc.,)。
力学探测系统是原子力显微镜力谱探测或者成像的重要核心系统,由微悬臂(Micro Cantilever)与坐落于微悬臂的尖端的针尖(Tip)组成,如图1.2所示,微悬臂是通常有长条状的矩形和等腰三角形两种形状,当然也有特殊定制的L型等等形状,其材质一般为氮化硅,二氧化硅或硅基等等。有些微悬臂的悬臂背部会被镀上金属材质的涂层,从而可以提高硅基材对光的反射效率,能够提高激光反射的信号检测灵敏度。由于原子力显微镜技术是通过针尖与基底上样品的相互作用的反馈而产生形貌的,这种相互作用可以达到极小的力值,例如达到皮牛顿级别,甚至可以通过远程的相互作用不接触到样品就能够对样品成像,其力学探测系统核心的灵敏检测限受到周围环境温度湿度等等、系统稳定性比如光电噪音等等的影响。为了能够驱动探针的运动,后方的微悬臂必须具有足够的动力能够带动针尖的运动。通过改变微悬臂的形状和材料等等方法,微悬臂能够提供合适的弹性系数,弹性系数小会使探针变软故能够提高力学探测系统的灵敏度,故检测下限能够向下拓展。原子力显微镜的光学检测系统主要由四个器件构成:它们分别是:1.四象限光电检测器(Position Sensitive);2.反射镜(Mirror);3.棱镜(Lens);4.激光二极管(Laser Diode)。激光二极管会发出一束非常集中的激光束,这束激光通过反射棱镜的反射,能够照射到微悬臂的尖端背部,随后在微悬臂的尖端背部再被反射出去。通过将这速反射出来的激光打四象限光电检测器上,就能够通过反射的原理扩大微悬臂的偏转,微悬臂的偏转在光电检测器能够放大将近一千倍,如1997年Hansma等人在杂志《International Journal of Imaging Systems and Technology》发表的报道,他们使用原子力显微镜,测算到四象限光电检测器上3-10 nm的位移只对应着微悬臂0.01 nm的偏转[55]。这样在使用原子力显微镜对非常微小的物体成像时,微小物体的形貌起伏会使得正在扫描的探针发生偏转,从而使从微悬臂背面反射到四象限的激光束的位置发生变化,通过电脑将各种偏转的方向和程度记录下来,最终根据电脑的计算和成处微小物体的形貌。
从磁场上分类可以分为磁镊(magnetic tweezers)、自由旋转磁镊(freely orbiting magnetic tweezers)、力矩磁镊(magnetic torque tweezers)。传统磁镊应用两块条形永磁铁产生磁场,如图1.4A给出了传统磁镊的示意图,并列的条形磁铁所提供给磁球的外磁场是沿着水平方向的。内部连接了“磁球-DNA”的样品池放置于高倍物镜上,磁铁放置在样品池的另一侧,对磁球施加磁力,进行单分子力学操纵。2011年,荷兰代尔夫特理工大学的Nynke Dekker课题组开发了自由旋转磁镊,他们将条形磁铁换为轴向充磁的环形磁铁,如图1.4B所示。这时候,施加在磁球上的磁场变成了沿竖直方向。磁感线由下而上,越往上越密集,磁场梯度依然存在,磁球仍然受到向上的力,然而由于磁场线沿竖直方向,磁球在水平方向不再受外来磁矩限制,可以自由转动。因为小球下方生物大分子的连接位点几乎不可能是在严格的正下方,在显微镜中可以看到小球以某一个点为圆心,在一个环状区域内自由转动。这个转动对应的正是下方所连分子自身的转到。自由旋转磁镊可以观察分子的转动却不能添加外加转矩。图1.4C是力矩磁镊。在自由旋转磁镊的环状磁铁外部加一个很小的磁铁,这样磁球会受到来自外界的一个很小的磁矩。转动磁铁,磁球随之转动但并不是完全同步。另外,从磁铁性质上分类可以分为永磁铁磁镊和电磁铁磁镊。永磁铁能够在不施加外界干扰的条件下提供较强的磁力。而电磁铁由于发热等外因影响,有时会对体系产生一定影响。但电磁铁的磁力和磁场控制更为精确便捷。
【参考文献】：
期刊论文
[1]单分子水平高分子相互作用的AFM成像与单分子力谱研究[J]. 张文科. 高分子学报. 2011(09)
[2]凝血酶的结构及其变构特性[J]. 许善峰,李芳,姜涌明,杨生妹. 中国医学生物技术应用. 2004(03)
本文编号：2935263
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