酶的固定化及酶活性荧光分析检测

发布时间：2017-04-14 02:12

  本文关键词：酶的固定化及酶活性荧光分析检测，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：酶是生物蛋白催化剂,它来源于自然界,并具有高效、专一的催化活性。伴随着科学技术的发展,酶也在诸多领域得到了较为广泛的应用。然而,来源于生命体的游离酶在高温、有机溶剂或极端pH下的不稳定性,使其在工业中的广泛应用受到一定限制。此外,反应体系中游离酶分离和提纯的难度较大,这也增加了其作为催化剂的使用成本。固定化酶技术有效地弥补了这些缺陷,成为解决游离酶利用问题的一个有效途径,并且为酶的深入应用开辟了广阔的前景。与游离酶相比,固定化酶不仅保持了其高效性和专一性的催化反应特性,还具有易分离回收、可重复使用、操作连续、制备工艺简便、增强酶稳定性等一系列优点。石墨烯量子点(GQDs)是尺寸在10 nm以下的零维纳米材料。相对于二维的石墨烯纳米片和一维的石墨烯纳米带,它除了具有比表面积大、载流子迁移率高、化学稳定性良好、对环境友好的特征之外,还具有量子限制效应和边界效应的特点。相对于传统的石墨类化合物,GQDs具有独特的荧光性质,可以根据粒径光致发射不同波长的荧光,吸引了各个领域研究者的关注。目前,GQDs已在生物医药、太阳能光电器件、发光二极管和生物酶传感器等诸多领域有了越来越广范的应用。本论文首先制备氨基化PGMA/EDMA微球,并分别通过SEM和压汞法对微球表面形貌和孔径分布进行了表征。随后使用两种不同的酶固定化方法,分别将α-淀粉酶和p-葡萄糖苷酶固定化到氨基功能化的微球上,并分别对酶的固定化条件和稳定性进行了优化和考察。随后,利用碳化二亚胺(EDC)和N-琥珀羟基酰亚胺(NHS)的交联化反应,分别将乙酰胆碱酯酶(AChE)和α-葡萄糖苷酶固定化到GQDs表面,并利用GQDs的荧光特性,建立基于GQDs荧光的纳米生物酶传感器,用于两种酶的定量分析及其抑制剂筛选。主要研究内容及结论如下：1.采用单分散聚合法制备PGMA/EDMA微球,并用乙二胺作为氨基化试剂将氨基接枝在微球表面,随后使用交联剂戊二醛,将α-淀粉酶成功共价交联固定化到氨基化微球上,固定化效率为35.1 mg/g。随后对固定化酶的操作条件和稳定性进行了研究。与游离酶相比,固定化酶的米氏常数和最大反应速率分别提高了12.94 mgmL-1和0.124 mmol mL-1min-1。同时耐酸性增强,90℃下的热稳定性由40%增加到61%,9次重复操作之后仍可保留58%的初始酶活性。最适宜条件下保存180 min后,固定化酶和游离酶的活力分别保持在80%和10%以上。2.对游离酶采用吸附、沉淀、交联的顺序,制备了聚合交联固定化β-葡萄糖苷酶,并对制备固定化酶的操作条件进行了优化。结果表明,固定化酶的两个动力学参数值Km和vmax分别为7.67μm和0.639μmol mL-1min-1,表明固定化酶比游离酶更具底物亲和性；最佳使用pH值和温度分别为5.5和60℃；连续重复使用9次后,固定化酶剩余活性仍然保持在90%以上；70℃条件下水浴恒温180 min后,固定化酶活力保持在80%以上,300 min后剩余50%初始活性；放置冰箱4℃储存,30 d后固定化酶剩余初始活性达到80%以上。最后,用纤维二糖作为底物进行水解,相对于游离酶,固定化酶极大地提高了纤维二糖的水解速率,由4h缩短至1 h,具有潜在的食品和生物乙醇生产的实际应用价值。3.利用EDC和NHS的交联作用,将AChE固定化到GQDs表面,同时GQDs的荧光也随之增强。随后用Hg2+将增强后的荧光猝灭,再利用酶解反应释放的胆碱化合物和Hg2+作用,形成Hg-S键,将GQDs-Hg2+体系解离,释放出GQDs,荧光得以恢复。根据以上原理设计了GQDs荧光纳米生物酶传感器,通过“荧光开关”现象建立了AChE的分析方法,线性范围为10-5～10-2U,检测限为2.3×10-6 U,并选用对氧磷和塔克林两种AChE抑制剂,对体系进行了酶活性抑制实验,得到两种模型抑制剂的半数抑制有效浓度分别为63.76 nM和14.07 nM。证明了基于GQDs增强荧光的纳米传感器可以对AChE进行活性分析,并且可以作为潜在的AChE抑制剂筛选工具。4.利用EDC和NHS的交联作用,将a-葡萄糖苷酶交联固定化到GQDs表面,再向体系中加入酶底物pNPG,水解后产生pNP,猝灭GQDs的荧光,猝灭率与酶的加入量呈线性关系,建立了α-葡萄糖苷酶分析方法,计算得出a-葡萄糖苷酶的线性检测范围为10-3～10-1 U,检测限为1.7×10-4 U。最后利用阳性药物阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶进行了活性抑制实验。实验结果表明,GQDs荧光纳米生物酶传感器可以对α-葡萄糖苷酶进行高灵敏度的活性检测,并且对其抑制剂的筛选具有进一步的利用价值。
【关键词】：固定化酶 石墨烯量子点 荧光纳米传感器 抑制剂筛选 PGMA/EDMA微球
【学位授予单位】：陕西师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：O657.3;O629.8
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-12
• 第1章 绪论12-36
• 1.1 固定化酶(immobilized enzyme)概述12-18
• 1.1.1 固定化酶概念12
• 1.1.2 固定化酶的制备方法12-14
• 1.1.3 固定化酶的制备原则14-15
• 1.1.4 固定化酶的性质15
• 1.1.5 固定化酶的评价指标15-16
• 1.1.6 固定化酶的应用16-18
• 1.2 乙酰胆碱酯酶(AChE)概述18-21
• 1.2.1 AChE的分子形式18-19
• 1.2.2 AChE的基因分析19
• 1.2.3 AChE的应用19-20
• 1.2.4 AChE抑制剂20-21
• 1.3 α-淀粉酶概述21-25
• 1.3.1 α-淀粉酶的结构特征21-22
• 1.3.2 α-淀粉酶的性质22
• 1.3.3 α-淀粉酶的应用22-23
• 1.3.4 α-淀粉酶的活性检测23-24
• 1.3.5 α-淀粉酶的固定化24-25
• 1.4 β-葡萄糖苷酶概述25-28
• 1.4.1 β-葡萄糖苷酶的来源25
• 1.4.2 β-葡萄糖苷酶的结构25-26
• 1.4.3 β-葡萄糖苷酶的分类26
• 1.4.4 β-葡萄糖苷酶的酶学性质26-27
• 1.4.5 β-葡萄糖苷酶的应用27
• 1.4.6 β-葡萄糖苷酶的固定化27-28
• 1.5 α-葡萄糖苷酶概述28-31
• 1.5.1 α-葡萄糖苷酶的来源28
• 1.5.2 α-葡萄糖苷酶的结构28
• 1.5.3 α-葡萄糖苷酶的理化性质28-29
• 1.5.4 α-葡萄糖苷酶的应用29
• 1.5.5 α-葡萄糖苷酶的抑制剂29-31
• 1.6 GQDs概述31-34
• 1.6.1 GQDs的制备31-33
• 1.6.2 GQDs的形貌表征33
• 1.6.3 GQDs的应用33-34
• 1.7 本论文研究内容及研究意义34-36
• 第2章 α-淀粉酶的固定化及其性质研究36-54
• 2.1 引言36-38
• 2.1.1 仪器与试剂37
• 2.1.2 主要试剂37-38
• 2.2 固定化载体的合成38-39
• 2.2.1 聚甲基丙烯酸环氧丙酯(P_(GMA/EDMA))微球的合成38-39
• 2.2.2 P_(GMA/EDMA)微球的修饰39
• 2.3 α-淀粉酶的固定化39
• 2.4 α-淀粉酶的活性测定39-40
• 2.5 α-淀粉酶的最适pH和温度40
• 2.6 α-淀粉酶的稳定性测试40-41
• 2.6.1 贮存稳定性测试40
• 2.6.2 重复使用性测试40
• 2.6.3 热稳定性测试40
• 2.6.4 动力学参数测定40-41
• 2.7 结果与讨论41-51
• 2.7.1 氨基化P_(GMA/EDMA)微球的表征41-43
• 2.7.2 固定化效率对比43
• 2.7.3 固定化条件的优化43-45
• 2.7.4 pH值和温度的优化45-47
• 2.7.5 固定化酶和自由酶的稳定性47-49
• 2.7.6 动力学参数对比49-51
• 2.8 本章小结51-54
• 第3章 β-葡萄糖苷酶的固定化及其性质研究54-68
• 3.1 引言54
• 3.2 实验部分54-57
• 3.2.1 主要试剂54-55
• 3.2.2 聚合交联固定化β-葡萄糖苷酶的制备55
• 3.2.3 酶活性的测定55
• 3.2.4 测定酶活的最优化条件55-56
• 3.2.5 动力学参数测定56
• 3.2.6 稳定性测试56
• 3.2.7 纤维二糖的水解56-57
• 3.3 结果与讨论57-66
• 3.3.1 β-葡萄糖苷酶固定化条件的选择57-60
• 3.3.2 聚合交联β-葡萄糖苷酶应用条件的选择60-62
• 3.3.3 固定化酶和游离酶的稳定性测试62-65
• 3.3.4 纤维二糖的水解65-66
• 3.4 本章小结66-68
• 第4章 基于增强荧光的GQDs纳米传感器用于乙酰胆碱酯酶的传感及其抑制剂筛选68-78
• 4.1 引言68
• 4.2 实验部分68-69
• 4.2.1 实验试剂68-69
• 4.2.2 AChE的固定化69
• 4.2.3 AChE的检测69
• 4.2.4 抑制剂对AChE的活性影响69
• 4.3 结果与讨论69-76
• 4.3.1 GQDs的表征69-70
• 4.3.2 AChE的固定化及荧光增强70-71
• 4.3.3 检测AChE活性的条件优化71-73
• 4.3.4 AChE活性检测73-74
• 4.3.5 AChE的抑制剂检测74-76
• 4.4 小结76-78
• 第5章 基于增强GQDs荧光的α-葡萄糖苷酶检测及其抑制剂筛选78-86
• 5.1 引言78
• 5.2 实验部分78-79
• 5.2.1 实验试剂78
• 5.2.2 α-葡萄糖苷酶的活性测定78-79
• 5.2.3 GQDs的增强荧光79
• 5.2.4 pNP对GQDs的荧光猝灭79
• 5.2.5 α-葡萄糖苷酶酶活性分析79
• 5.3 结果与讨论79-85
• 5.3.1 酶促反应的条件优化79-81
• 5.3.2 pNP的荧光猝灭作用81-82
• 5.3.3 荧光法检测α-葡萄糖苷酶活性82-84
• 5.3.4 α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选84-85
• 5.4 小结85-86
• 第6章 总结86-88
• 参考文献88-102
• 致谢102-104
• 攻读博士学位期间研究成果104

  本文关键词：酶的固定化及酶活性荧光分析检测，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：304979