高灵敏度的毛细管凝胶电泳—紫外检测核酸体系的建立及其在何首乌分子鉴定中的应用

发布时间：2017-04-21 17:23

  本文关键词：高灵敏度的毛细管凝胶电泳—紫外检测核酸体系的建立及其在何首乌分子鉴定中的应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：灵敏度低是毛细管电泳技术分析核酸的关键难题,同时也是建立基于核酸检测的毛细管电泳体系及其应用的关键限制性因素。为解决灵敏度问题,建立起高效、高灵敏分析核酸的毛细管电泳体系,本研究运用场放大富集技术提高毛细管凝胶电泳-紫外检测核酸灵敏度并将建立后的方法应用于何首乌的分子鉴定,主要的研究成果如下:1通过充分阅读文献资料,深度调研了建立基于核酸检测的毛细管凝胶电泳-紫外检测体系存在的问题、提出拟解决问题的技术路线及高灵敏度的毛细管电泳体系建立后应用于核酸分析的具体技术步骤。(1)提出运用场放大富集技术解决毛细管电泳-紫外检测核酸灵敏度低的难题,其中首次提出将场放大富集细分为M-FASI和C-FASI两种模式,并分析C-FASI可能获得高灵敏度的机制。从而为解决关键的灵敏度问题提供了技术路线、奠定了理论基础。(2)提出高灵敏度的毛细管电泳-紫外检测核酸灵敏度体系建立后,应与各种核酸分析策略结合,即优化PCR策略+CE检测两个步骤,才能构成完善的核酸分析体系,从而为建立后的毛细管电泳体系应用于何首乌的分子鉴定提供技术路线。2运用场放大样品堆积(FASS)技术提高毛细管电泳-紫外检测核酸灵敏度,优化的FASS条件为水柱注射(0.5 psi,40 s),样品注射(25 psi,90 s),TE为样品稀释溶液,分离电压-250 V/cm。优化条件下,FASS与普通压力注射模式(0.5 psi,10 s)相比,灵敏度提高665倍,DNA检测限降至20 ng/m L。实验证明场放大富集效应远高于稀释效应,并据此提出了大量稀释核酸样品后再富集以检测高盐状态核酸样品的新策略。为验证该策略,未经纯化的?X174-HaeⅢ酶切消化的DNA产物测试FASS,FASS成功检测出11条带验证了FASS的有效性。方法的线性范围为20-400 ng/m L,回归方程为Y=92.10X-736.5,相关系数为0.999。峰面积和迁移时间的RSD分别为(1.07-5.36)和(0.04-0.91),表明FASS具有良好的定性、定量及稳定性,是有效提高核酸检测灵敏度的场放大富集模式之一3 FASS虽极大提高了进样量,但由于进样时间的增加及存于管中过长的样品柱对分离场强的干扰,造成分析时间的增加,且压力法提高灵敏度的效果受限于管容积。因此,采用电动注射模式的基质场放大堆积注射(M-FASI)进一步提高CGE-UV检测核酸的灵敏度。优化的M-FASI条件为:样品稀释溶液为(50μM tris-Hcl和5μM EDTA)/L的TE,样品电动注射(-10 k V,50 s),分离电压250 V/cm。优化条件下,M-FASI检测DNA的检测限(S/N=3)为4 ng/m L,灵敏度是常规电动注射样品(10 k V,10 s)的100倍,是FASS的4倍。M-FASI的富集效应远大于稀释效应,成功检测未经纯化的?X174-HaeⅢ酶切消化的DNA产物验证了M-FASI的有效性。方法的线性范围为20-134 ng/m L,迁移时间和峰面积的日间及日内精密度分别为0.04-0.91和0.66-6.21,表明M-FASI的定性和定量良好,是分析微量DNA样品的有效方法4电动模式的M-FASI虽进一步提高了灵敏度,但其存在样品溶液(高场强)与管口BGE(低场强)的交界面易于受到扰动、电动注射样品时间受限及焦耳热干扰分离效率等问题,为达到进一步稳定堆积界面并运用毛细管凝胶电泳-紫外检测高灵敏的分析微量核酸的目的,联合使用基质场放大和柱头场放大堆积注射(C-FASI)以充分发挥两种方法的优势并克服M-FASI和FASS的不足。在没有降低分离度下,稀释达30万倍的DNA样品被C-FASI富集并检测出来,此时,100-400 bp条带(浓度最低)的检测限为0.13 ng/m L(S/N=3)。此灵敏度为常规压力进样的102308倍、常规电动进样的3077倍、压力场放大样品堆积的154倍和基质场放大堆积注射的31倍。C-FASI的富集效应同样远大于稀释效应,线性范围为0.8-20 ng/m L,峰的迁移时间和峰面积的相对标准偏差分别为0.03-1.15和0.72-6.42。方法建立后,检测未经纯化的?X174-Hae III酶切消化DNA,5000倍稀释、总浓度为10 ng/m L的?X174-Hae III酶切消化DNA被C-FASI成功的富集并检测。C-FASI检测稀释1000倍、未经纯化的400 bp PCR产物以进一步验证其可用于实际核酸样品分析,并在稀释至6000倍时达到检测限(S/N=3),峰的迁移时间和峰面积的相对标准偏差分别为0.44和4.8。这些结果表明基于C-FASI的CGE-UV分析核酸的灵敏度高、定性和定量良好、操作简便、实用、可靠,是高效的核酸分析工具。5高灵敏度的CGE-UV分析核酸体系建立后,为验证体系的有效性,基于场放大富集的CGE-UV PCR-RFLP分子鉴定何首乌及其伪品,并与及传统的平板凝胶电泳比较,实验显示两种方法均可有效鉴定何首乌及其伪品。但毛细管凝胶电泳的灵敏度是平板凝胶电泳的6000倍以上且具有分析效率达百万塔板以上、图谱清晰、分析自动化并可同步处理数据、清洁无污染、对操作者健康、性价比高、可定量且定性、定量精度良好等优势,表明基于场放大富集的CGE-UV具有替代平板凝胶电泳分析DNA的巨大潜力。但由于PCR-RFLP步骤的耗时达5.5个小时,不利于PCR-RFLP-CGE-UV分子鉴定体系快速鉴别何首乌。因此,实验进一步优化鉴定方法的PCR策略。6 SNP-PCR代替PCR-RFLP与CGE-UV结合(SNP-PCR-CGE-UV)以高速鉴定何首乌,其能在23分钟内完成从PCR到DNA检测及数据分析全过程,是目前所有何首乌分子鉴定方法中速度最快的方法,并在PCR-RFLP-CGE-UV的基础上进一步降低成本,是真正意义的上的高速、高通量和高性价比的何首乌分子鉴定体系。SNP-PCR-CGE-UV从PCR策略+DNA检测方式两方面优化核酸分析体系,为CGE-UV在其它核酸分析领域的应用提供了一个范例,同时实验也显示了基于场放大富集的CGE-UV替代平板凝胶电泳分析DNA的巨大潜力。从以上研究结果可以得出:场放大富集成功解决了毛细管凝胶电泳-紫外检测核酸体系的灵敏度问题并可用于实际的高盐、微量核酸样品的分析,已奠定了毛细管电泳技术在核酸分析领域应用的基础。何首乌分子鉴定中,CGE-UV与SNP-PCR结合的优化过程也为毛细管电泳在其它核酸分析领域的应用提供了范例和思路。这些显示了高灵敏度的毛细管凝胶电泳-紫外检测核酸体系在未来核酸分析中的巨大应用潜力。
【关键词】：毛细管电泳 灵敏度 场放大富集 核酸 何首乌
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R284;O658.9
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-16
• 第一章 绪论16-64
• 前言16
• 1 毛细管电泳的基本原理16-19
• 1.1 毛细管凝胶电泳17
• 1.2 分离度17-18
• 1.3 电渗流18
• 1.4 毛细管电泳的电泳类型18-19
• 2 毛细管电泳在核酸分析上的优势19-21
• 3 毛细管电泳技术在核酸分析领域的应用21-31
• 3.1 细菌病原体的鉴定、基因分型和耐药性研究22-23
• 3.2 病毒诊断23
• 3.3 遗传性疾病诊断23-25
• 3.4 肿瘤诊断25-28
• 3.5 其它相关诊断28-29
• 3.6 RNA分析29-30
• 3.7 诊断新方法30-31
• 4 毛细管电泳技术在核酸分析上存在的问题31-33
• 5 毛细管电泳场放大富集技术概述33-59
• 5.1 场放大富集的基本原则33-56
• 5.2 毛细管场放大富集技术的优势，缺点和今后的发展趋势56-59
• 6 技术路线59-60
• 7 课题的主要研究内容及目的60-64
• 第二章 场放大样品堆积提高毛细管凝胶电泳-紫外检测核酸灵敏度64-77
• 前言64
• 1.实验仪器、材料和方法64-66
• 1.1 实验仪器64-65
• 1.2 实验材料65
• 1.3 实验方法65-66
• 2 结果与分析66-75
• 2.1 评估毛细管电泳体系的稳定性66-67
• 2.2 场放大样品堆积的机制67
• 2.3 常规压力进样的检测灵敏度67
• 2.4 场放大样品堆积参数的优化67-72
• 2.5 场放大样品堆积的检测灵敏度72
• 2.6 FASS的场放大富集效果远大于稀释效应72-73
• 2.7．FASS的线性，精密度和重复性73-75
• 3 本章小结75-76
• 4 FASS的不足76-77
• 第三章 基质场放大堆积注射提高毛细管凝胶电泳-紫外检测核酸灵敏度77-88
• 前言77
• 1.实验仪器、材料和方法77-79
• 1.1 实验仪器77-78
• 1.2 实验材料78
• 1.3 实验方法78-79
• 2 结果和讨论79-86
• 2.1 基质场放大堆积注射的机制79
• 2.2 常规电动进样的检测灵敏度79-80
• 2.3 分离电压的优化80
• 2.4 基质场放大堆积注射参数的优化80-83
• 2.5 基质场放大堆积注射的灵敏度83
• 2.6 M-FASI的场放大富集效应远大于稀释效应83-85
• 2.7 M-FASI的线性，精密度和重复性85-86
• 3 本章小结86-87
• 4 M-FASI方法的不足87-88
• 第四章 联合使用基质场放大和柱头场放大堆积注射提高毛细管凝胶电泳-紫外检测核酸灵敏度88-114
• 前言88-89
• 1 实验仪器、材料和方法89-92
• 1.1 实验仪器及设备89
• 1.2 实验材料89-91
• 1.3 方法91-92
• 2 结果与讨论92-111
• 2.1 场放大富集技术的基本原理92
• 2.2 C-FASI的机制92-95
• 2.3 分离条件的优化95-96
• 2.4 C-FASI条件的优化96-101
• 2.5 C-FASI的富集效应远大于稀释效应101-104
• 2.6 C-FASI与其它富集技术在提高核酸检测灵敏度方面的比较104-107
• 2.7 C-FASI的线性、精密度和重复性107-111
• 3 结论111
• 4 讨论111-113
• 5 本章小结113-114
• 第五章 基于场放大富集的CGE-UV在何首乌PCR-RFLP分子鉴定中的应用114-132
• 前言114-115
• 1 实验材料、实验仪器和实验方法115-120
• 1.1 实验材料115-117
• 1.2 实验仪器和设备117-118
• 1.3 实验方法118-120
• 2 结果与分析120-126
• 2.1 ITS2序列的扩增结果及序列分析120
• 2.2 ITS2序列的酶谱分析120-121
• 2.3 基于平板凝胶电泳的PCR-RFLP分子鉴定何首乌植物及其伪品121-122
• 2.4 基于毛细管凝胶电泳的PCR-RFLP分子鉴定何首乌及其伪品122-126
• 3 讨论126-130
• 4 本章小结130-132
• 第六章 基于场放大富集的CGE-UV在SNP-PCR鉴定何首乌及其伪品中的应用132-145
• 前言132-133
• 1 实验材料、实验仪器和实验方法133-136
• 1.1 实验材料133-134
• 1.2 实验仪器和设备134
• 1.3 实验方法134-136
• 2 结果与分析136-141
• 2.1 SNP特异性引物的设计136
• 2.2 PCR反应条件的确定136-139
• 2.3 何首乌植物及中药材特异性引物PCR鉴别139
• 2.4 基于毛细管凝胶电泳的SNP-PCR鉴定何首乌及其伪品139-141
• 3 讨论141-144
• 4 本章小结144-145
• 结论与展望145-148
• 1 结论145-146
• 2 本论文的创新点146
• 3 展望146-148
• 参考文献148-172
• 附录172-174
• 攻读博士学位期间取得的研究成果174-176
• 致谢176-177
• 附件177

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：320862