以四肽为配基的仿生层析和抗体的分离纯化
发布时间：2021-06-07 17:45
抗体是一类重要的生物技术药物,具有广阔的应用前景。目前,蛋白A亲和层析是抗体分离的平台技术,具有高度特异性,但是存在成本高、洗脱条件苛刻、蛋白配基易脱落等问题。寻求经济高效的抗体分离新方法,具有重要的意义。混合模式层析和短肽仿生层析是目前抗体分离的新技术,目前对其的认识还不够深入。本论文以抗体的高效分离为目标,以混合模式层析介质分离抗体为起步,比较和评价混合模式配基在分离抗体时的作用和效果,然后分子对接比较混合模式配基和短肽配基,得出短肽配基对抗体具有更好的选择性。利用分子模拟分析短肽配基-抗体相互作用,以此作为设计四肽配基库的重要依据,筛选出相应的四肽配基,用于制备以新型四肽为配基的仿生层析介质,以提高抗体的分离性能。首先比较了四种商业化混合模式介质对抗体的分离性能,分别是Bestarose Diamond MMA、Bestarose Diamond MMC、MEP HyperCel和PPA HyperCel。以人免疫球蛋白（hIgG）和牛血清白蛋白（BSA）混合料液为分离对象,采用上述四种介质进行了分离纯化的比较。pH梯度洗脱结果表明,Bestarose Diamond MMA抗体...
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：162 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
缩略语表
第一章 文献综述
1.1 引言
1.2 抗体
1.3 单克隆抗体的分离纯化
1.3.1 层析法
1.3.2 非层析法
1.4 蛋白A替代配基
1.4.1 亲硫配基
1.4.2 疏水电荷诱导配基
1.4.3 混合模式配基
1.4.4 仿生配基
1.5 短肽仿生配基的设计和筛选
1.5.1 组合化学技术
1.5.2 噬菌体展示技术
1.5.3 mRNA展示技术
1.5.4 计算模拟辅助技术
1.6 本文研究思路
第二章 混合模式层析分离抗体
2.1 引言
2.2 材料和方法
2.2.1 试剂与仪器
2.2.2 静态吸附容量测定
2.2.3 pH梯度洗脱层析
2.2.4 pH阶跃洗脱层析
2.2.5 盐梯度洗脱层析
2.2.6 高盐上样淋洗层析
2.2.7 SEC-HPLC分析
2.2.8 非还原SDS-PAGE分析
2.2.9 ζ电位测定
2.3 结果与讨论
2.3.1 pH调控
2.3.2 盐浓度调控
2.4 本章小结
第三章 DAAG配基-抗体相互作用的机制分析
3.1 引言
3.2 计算模拟方法
3.2.1 分子建模
3.2.2 分子对接
3.2.3 分子动力学模拟
3.2.4 相互作用能计算
3.3 结果与讨论
3.3.1 混合模式配基与短肽配基的比较分析
3.3.2 DAAG结合位点的确定
3.3.3 DAAG结合机制分析
3.3.4 DAAG解离机制分析
3.3.5 配基作用模式分析
3.4 本章小结
第四章 四肽配基的理性设计与初步评价
4.1 引言
4.2 四肽配基库建立与筛选方法
4.2.1 四肽配基库建立
4.2.2 初步筛选
4.2.3 二次筛选
4.2.4 相互作用能分析
4.3 材料与方法
4.3.1 试剂与仪器
4.3.2 Bestarose 4FF氨基活化和氨基密度测定
4.3.3 短肽偶联和短肽密度测定
4.3.4 吸附等温线测定
4.3.5 蛋白混合物中分离IgG
4.3.6 SEC-HPLC分析
4.3.7 非还原SDS-PAGE分析
4.4 结果与讨论
4.4.1 四肽配基库的建立
4.4.2 初步筛选——柔性对接
4.4.3 二次筛选——分子动力学模拟
4.4.4 Fc片段与四肽配基的相互作用分析
4.4.5 四肽介质制备
4.4.6 吸附等温线
4.4.7 蛋白混合液中分离hIgG
4.5 本章小结
第五章 新型四肽介质的抗体吸附和分离性能
5.1 引言
5.2 材料与方法
5.2.1 试剂与仪器
5.2.2 Bestarose 4FF氨基活化和氨基密度测定
5.2.3 四肽偶联和四肽密度测定
5.2.4 吸附等温线测定
5.2.5 吸附动力学测定
5.2.6 动态载量测定
5.2.7 牛乳清中分离IgG
5.2.8 细胞培养上清液中分离单抗
5.2.9 抗体纯度和收率分析
5.2.10 非还原SDS-PAGE与还原SDS-PAGE分析
5.3 结果与讨论
5.3.1 吸附等温线
5.3.2 吸附动力学
5.3.3 10%穿透的动态载量
5.3.4 牛乳清中分离IgG
5.3.5 CHO细胞培养上清液中分离单抗
5.4 本章小结
第六章 总结和展望
6.1 总结
6.2 展望
参考文献
攻读博士学位期间的研究成果
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]静脉注射人免疫球蛋白在重症小儿手足口病治疗中的临床观察[J]. 张敏,赵艳雪,王刚. 河北医药. 2011(10)
[2]4-巯乙基吡啶配基与IgG相互作用的分子模拟研究[J]. 王红寅,林东强,姚善泾,贠军贤,姚克俭. 化学学报. 2010(16)
[3]单克隆抗体在肿瘤治疗中的应用[J]. 侯盛,郭亚军. 中国处方药. 2007(04)
[4]人肺癌相关单克隆抗体的制备及其抗原的纯化[J]. 姚晓玲,柳晓燕,吴强,徐振山,宋礼华. 中国免疫学杂志. 2006(12)
[5]静脉注射用人免疫球蛋白辅治小儿毛细支气管炎的疗效观察[J]. 赵兰玉,王健,林敦彬,曾艾. 福建医药杂志. 2006(02)
[6]小剂量静脉注射用人免疫球蛋白治疗6例重症寻常型天疱疮的疗效观察[J]. 杨小英,陈思远,黄长征. 临床皮肤科杂志. 2005(09)
[7]静脉注射用免疫球蛋白辅助治疗婴幼儿哮喘11例报告[J]. 赵高平,王军,王艳玲. 宁夏医学杂志. 2004(09)
[8]静脉注射用人免疫球蛋白的临床应用现状[J]. 王艳红. 首都医药. 2004(18)
[9]五种艾滋病病毒抗体诊断试剂临床质量比较[J]. 马义才,贾桂芳,周琼秀,郑鹏,刘福荣,季阳. 中国艾滋病性病. 2002(04)
[10]戊型肝炎病毒IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒研制[J]. 庄辉,崔怡辉,朱万孚,朱永红,徐国民. 中华预防医学杂志. 2001(05)
本文编号：3217023
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：162 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
缩略语表
第一章 文献综述
1.1 引言
1.2 抗体
1.3 单克隆抗体的分离纯化
1.3.1 层析法
1.3.2 非层析法
1.4 蛋白A替代配基
1.4.1 亲硫配基
1.4.2 疏水电荷诱导配基
1.4.3 混合模式配基
1.4.4 仿生配基
1.5 短肽仿生配基的设计和筛选
1.5.1 组合化学技术
1.5.2 噬菌体展示技术
1.5.3 mRNA展示技术
1.5.4 计算模拟辅助技术
1.6 本文研究思路
第二章 混合模式层析分离抗体
2.1 引言
2.2 材料和方法
2.2.1 试剂与仪器
2.2.2 静态吸附容量测定
2.2.3 pH梯度洗脱层析
2.2.4 pH阶跃洗脱层析
2.2.5 盐梯度洗脱层析
2.2.6 高盐上样淋洗层析
2.2.7 SEC-HPLC分析
2.2.8 非还原SDS-PAGE分析
2.2.9 ζ电位测定
2.3 结果与讨论
2.3.1 pH调控
2.3.2 盐浓度调控
2.4 本章小结
第三章 DAAG配基-抗体相互作用的机制分析
3.1 引言
3.2 计算模拟方法
3.2.1 分子建模
3.2.2 分子对接
3.2.3 分子动力学模拟
3.2.4 相互作用能计算
3.3 结果与讨论
3.3.1 混合模式配基与短肽配基的比较分析
3.3.2 DAAG结合位点的确定
3.3.3 DAAG结合机制分析
3.3.4 DAAG解离机制分析
3.3.5 配基作用模式分析
3.4 本章小结
第四章 四肽配基的理性设计与初步评价
4.1 引言
4.2 四肽配基库建立与筛选方法
4.2.1 四肽配基库建立
4.2.2 初步筛选
4.2.3 二次筛选
4.2.4 相互作用能分析
4.3 材料与方法
4.3.1 试剂与仪器
4.3.2 Bestarose 4FF氨基活化和氨基密度测定
4.3.3 短肽偶联和短肽密度测定
4.3.4 吸附等温线测定
4.3.5 蛋白混合物中分离IgG
4.3.6 SEC-HPLC分析
4.3.7 非还原SDS-PAGE分析
4.4 结果与讨论
4.4.1 四肽配基库的建立
4.4.2 初步筛选——柔性对接
4.4.3 二次筛选——分子动力学模拟
4.4.4 Fc片段与四肽配基的相互作用分析
4.4.5 四肽介质制备
4.4.6 吸附等温线
4.4.7 蛋白混合液中分离hIgG
4.5 本章小结
第五章 新型四肽介质的抗体吸附和分离性能
5.1 引言
5.2 材料与方法
5.2.1 试剂与仪器
5.2.2 Bestarose 4FF氨基活化和氨基密度测定
5.2.3 四肽偶联和四肽密度测定
5.2.4 吸附等温线测定
5.2.5 吸附动力学测定
5.2.6 动态载量测定
5.2.7 牛乳清中分离IgG
5.2.8 细胞培养上清液中分离单抗
5.2.9 抗体纯度和收率分析
5.2.10 非还原SDS-PAGE与还原SDS-PAGE分析
5.3 结果与讨论
5.3.1 吸附等温线
5.3.2 吸附动力学
5.3.3 10%穿透的动态载量
5.3.4 牛乳清中分离IgG
5.3.5 CHO细胞培养上清液中分离单抗
5.4 本章小结
第六章 总结和展望
6.1 总结
6.2 展望
参考文献
攻读博士学位期间的研究成果
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]静脉注射人免疫球蛋白在重症小儿手足口病治疗中的临床观察[J]. 张敏,赵艳雪,王刚. 河北医药. 2011(10)
[2]4-巯乙基吡啶配基与IgG相互作用的分子模拟研究[J]. 王红寅,林东强,姚善泾,贠军贤,姚克俭. 化学学报. 2010(16)
[3]单克隆抗体在肿瘤治疗中的应用[J]. 侯盛,郭亚军. 中国处方药. 2007(04)
[4]人肺癌相关单克隆抗体的制备及其抗原的纯化[J]. 姚晓玲,柳晓燕,吴强,徐振山,宋礼华. 中国免疫学杂志. 2006(12)
[5]静脉注射用人免疫球蛋白辅治小儿毛细支气管炎的疗效观察[J]. 赵兰玉,王健,林敦彬,曾艾. 福建医药杂志. 2006(02)
[6]小剂量静脉注射用人免疫球蛋白治疗6例重症寻常型天疱疮的疗效观察[J]. 杨小英,陈思远,黄长征. 临床皮肤科杂志. 2005(09)
[7]静脉注射用免疫球蛋白辅助治疗婴幼儿哮喘11例报告[J]. 赵高平,王军,王艳玲. 宁夏医学杂志. 2004(09)
[8]静脉注射用人免疫球蛋白的临床应用现状[J]. 王艳红. 首都医药. 2004(18)
[9]五种艾滋病病毒抗体诊断试剂临床质量比较[J]. 马义才,贾桂芳,周琼秀,郑鹏,刘福荣,季阳. 中国艾滋病性病. 2002(04)
[10]戊型肝炎病毒IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒研制[J]. 庄辉,崔怡辉,朱万孚,朱永红,徐国民. 中华预防医学杂志. 2001(05)
本文编号：3217023
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