核桃壳中黄嘌呤氧化酶抑制活性物质的分离鉴定及构效关系的研究

发布时间：2017-04-24 22:11

  本文关键词：核桃壳中黄嘌呤氧化酶抑制活性物质的分离鉴定及构效关系的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：高尿酸血症是人类常见的代谢疾病,会导致关节和肾脏形成尿酸盐结晶,同时会增加患痛风性关节炎、尿酸肾石病、心血管疾病和高血压等的风险。黄嘌呤氧化酶是嘌呤代谢的关键酶,该酶可以催化次黄嘌呤转化为黄嘌呤,进而将黄嘌呤转化为尿酸,与高尿酸血症的形成息息相关。因而服用黄嘌呤氧化酶抑制剂是治疗高尿酸血症的非常有效的方法之一。但是,目前广泛使用的临床药物别嘌呤醇会导致一系列副作用,例如过敏反应、Steven-Johnson症状和肾脏毒性等,因此治疗高尿酸血症需要更加安全有效的黄嘌呤氧化酶抑制剂。文献报道表明植物中的天然活性物质既是潜在的黄嘌呤氧化酶抑制剂,同时又是良好的抗氧化剂。核桃属于胡桃科胡桃属植物,广泛的分布于世界各地,核桃壳质量约占核桃质量的30%,核桃加工后会产生大量的核桃壳。本论文研究了核桃壳的提取物的体内降尿酸活性,并期望从中寻找出新型的黄嘌呤氧化酶抑制剂,现将主要研究结果归纳如下:(1)优化了评定样品黄嘌呤氧化酶抑制活性的催化反应条件,将测定酚类物质的黄嘌呤氧化酶抑制活性的高效液相色谱法和分光光度法进行了对比研究。优化后的催化反应条件为:底物浓度0.24 mM、酶浓度0.01 U/m L、催化反应温度25oC、pH值7.5、催化反应时间30 min和终止反应用HCl溶液(1.0 M)的体积80μL。两种方法在尿酸的检测浓度范围内都具有较好的线性关系和较高的日内精密度,但高效液相色谱法的检出限和定量限比分光光度法大约低了一个数量级,灵敏度较高。分光光度法在检测活性较弱的物质或在292 nm处有强吸收的酚类物质的黄嘌呤氧化酶抑制活性时结果会偏高。相比之下测定黄嘌呤氧化酶抑制活性的高效液相色谱法消除了干扰,并可以在不控温的情况下21 h内检测有效,每个样品检测只需8 min,可用于样品的高通量筛选。同时高效液相法的日间精密度在0.10-1.50%的范围内,说明该法具有较高的日间精密度。(2)为了从核桃果实及其副产物中筛选出合适的原料,对核桃果实(青皮、壳和仁)、茎和叶提取物的抗氧化活性和黄嘌呤氧化酶抑制活性进行了对比研究。核桃壳提取率较低(提取率为2.80%),但其提取物的总酚含量(14.81±0.50 GAE g/100 g,GAE没食子酸当量)最高,抗氧化活性(ORAC 3423.44±142.52μmol TE/g,TE为Trolox当量,还原力115.86±2.05μg/mL)最优,黄嘌呤氧化酶抑制活性仅次于核桃青皮提取物(核桃壳和青皮提取物抑制黄嘌呤氧化酶的半数抑制浓度分别为988.36±31.31μg/mL和616.86±17.84μg/mL),在保健食品工业中具有潜在的应用价值。同时,通过高效液相分析谱图发现核桃果实不同部分(青皮、壳和脱脂核桃仁)、茎和叶提取物组成存在着一定的差异,但均具有相同的特征峰,说明这些样品的主要成分比较接近。(3)探讨了核桃壳提取物在高尿酸大鼠体内的降尿酸活性,并在体外进行了以黄嘌呤氧化酶抑制活性为导向的分离、纯化和结构鉴定。按照166 mg/kg核桃壳提取物的剂量灌胃大鼠30 d,发现灌胃核桃壳提取物不会影响大鼠的体重;灌胃20 d时该组大鼠的血尿酸含量明显低于模型组大鼠(核桃壳提取物组vs模型组,p0.05),在30 d时血尿酸含量降低到模型组的76.41%(核桃壳提取物组vs模型组,p0.05),同时大鼠血清中的尿素氮和肌酐含量(核桃壳提取物组vs模型组;尿素氮p0.01,肌酐p0.05)明显降低,说明核桃壳提取物具有体内降尿酸活性和肾脏保护作用。以黄嘌呤氧化酶抑制活性为导向进行分离纯化,鉴定出了对香豆醛、β-D-胡萝卜苷、对羟基苯甲醛和氢化胡桃醌这四种物质。其中对香豆醛的黄嘌呤氧化酶抑制活性最强,为混合性抑制剂,与别嘌呤醇具有协同增效作用。核桃壳提取物和对香豆醛可以作为预防和治疗高尿酸血症及痛风的活性物质。(4)基于对香豆醛及其结构类似物,探讨了黄嘌呤氧化酶抑制活性的构效关系,并对对香豆醛抑制黄嘌呤氧化酶的机制进行了探讨。体外的黄嘌呤氧化酶抑制活性和分子对接结果表明对香豆醛的醛基、双键和羟基对其黄嘌呤氧化酶抑制活性具有重要贡献。对香豆醛与黄嘌呤氧化酶之间相互作用主要包括对香豆醛与苯丙氨酸-914和苯丙氨酸-1009之间的苯环与苯环的相互作用,羟基与谷氨酸-1261和精氨酸-880之间的两个氢键,醛基与苏氨酸-1010和缬氨酸-1011之间的两个氢键。通过改变对香豆醛本身基团的位置和增加基团进一步探讨了对香豆醛及其衍生物抑制黄嘌呤氧化酶的构效关系,结果表明在对香豆醛的基础上寻找活性更好的黄嘌呤氧化酶抑制剂,需要引入加强醛基亲电性的基团,同时要保持物质的线性结构;对香豆醛抑制黄嘌呤氧化酶活性的机制也进一步证实了对香豆醛醛基的亲电性对于黄嘌呤氧化酶抑制活性的重要性。
【关键词】：核桃壳 尿酸 黄嘌呤氧化酶 对香豆醛
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS209
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-15
• 第一章 绪论15-46
• 1.1 尿酸、高尿酸血症和痛风15-16
• 1.2 植物提取物的降尿酸活性研究16-18
• 1.3 黄嘌呤氧化酶与酶抑制作用类型18-20
• 1.3.1 黄嘌呤氧化酶18
• 1.3.2 酶抑制作用的类型18-20
• 1.4 黄嘌呤氧化酶抑制剂20-32
• 1.4.1 含氮杂环类抑制剂20-24
• 1.4.2 含氧杂环类抑制剂24-30
• 1.4.3 其它类型的抑制剂30-32
• 1.5 氧化应激和黄嘌呤氧化酶32-33
• 1.6 核桃的研究与开发利用现状33-37
• 1.6.1 核桃壳的物质基础与生物活性研究33-34
• 1.6.2 核桃青皮的物质基础与生物活性研究34-35
• 1.6.3 核桃内种皮的物质基础与生物活性研究35
• 1.6.4 核桃仁及核桃饼粕的物质基础与生物活性研究35-36
• 1.6.5 核桃叶的物质基础与生物活性研究36-37
• 1.7 本课题研究的立题依据和主要研究内容37-38
• 1.7.1 立题依据37
• 1.7.2 主要研究内容37-38
• 参考文献38-46
• 第二章 分光光度法和高效液相色谱法测定酚类物质黄嘌呤氧化酶抑制活性的对比研究46-65
• 2.1 前言46-47
• 2.2 实验材料与仪器47-48
• 2.2.1 试剂47
• 2.2.2 主要仪器设备47-48
• 2.3 实验方法48-51
• 2.3.1 溶液的配制48
• 2.3.2 初始的黄嘌呤氧化酶催化反应条件48-49
• 2.3.3 黄嘌呤氧化酶抑制活性测定的分光光度法49
• 2.3.4 黄嘌呤氧化酶抑制活性测定的高效液相色谱法49
• 2.3.5 黄嘌呤氧化酶抑催化反应条件的优化49-50
• 2.3.6 方法学验证50
• 2.3.7 潜在的干扰物对分光光度法测定抑制活性的影响50-51
• 2.3.8 数据分析51
• 2.4 结果与讨论51-60
• 2.4.1 黄嘌呤氧化酶催化反应条件的优化51-54
• 2.4.2 两种方法测定尿酸时的线性相关性比较54
• 2.4.3 两种方法日内精密度的对比研究54-55
• 2.4.4 催化反应体系中的物质对分光光度法测定黄嘌呤氧化酶抑制活性的影响55-57
• 2.4.5 黄嘌呤氧化酶抑制活性测定的高效液相色谱法57-58
• 2.4.6 高效液相色谱法稳定性和日间精密度的研究58-60
• 2.5 本章小结60-61
• 参考文献61-65
• 第三章 核桃果实、茎和叶提取物抗氧化和黄嘌呤氧化酶抑制活性的研究65-77
• 3.1 前言65
• 3.2 实验材料与仪器65-67
• 3.2.1 试剂65-66
• 3.2.2 主要仪器设备66
• 3.2.3 原料66-67
• 3.3 实验方法67-70
• 3.3.1 样品醇提物的制备67
• 3.3.2 总酚含量的测定67-68
• 3.3.3 氧自由基吸收能力（ORAC）的测定68
• 3.3.4 还原力的测定68
• 3.3.5 黄嘌呤氧化酶抑制活性的测定68-69
• 3.3.6 各样品的高效液相色谱分析69
• 3.3.7 数据分析69-70
• 3.4 结果与讨论70-73
• 3.4.1 样品的提取率和多酚含量70
• 3.4.2 样品的抗氧化活性70-72
• 3.4.3 样品的黄嘌呤氧化酶抑制活性72
• 3.4.4 样品的高效液相色谱分析72-73
• 3.5 本章小结73
• 参考文献73-77
• 第四章 核桃壳提取物的体内降尿酸活性及活性物质的分离、纯化和鉴定77-96
• 4.1 前言77-78
• 4.2 实验材料与仪器78-80
• 4.2.1 试剂78-79
• 4.2.2 仪器与设备79
• 4.2.3 实验用大鼠79-80
• 4.3 实验方法80-82
• 4.3.1 核桃壳提取物的制备80
• 4.3.2 核桃壳提取物体内降尿酸活性的研究80
• 4.3.3 总酚含量的测定80-81
• 4.3.4 氧自由基吸收能力（ORAC）的测定81
• 4.3.5 还原力的测定81
• 4.3.6 DPPH·清除能力的测定81
• 4.3.7 黄嘌呤氧化酶抑制活性的测定81
• 4.3.8 以活性为导向，分离和纯化核桃壳提取物中的活性物质81-82
• 4.3.9 活性物质的鉴定82
• 4.3.10 样品的黄嘌呤氧化酶抑制类型和抑制常数研究82
• 4.3.11 数据分析82
• 4.4 结果与讨论82-92
• 4.4.1 核桃壳提取物体内降尿酸活性研究82-85
• 4.4.2 以活性为导向，分离、纯化和鉴定核桃壳提取物内活性物质85-90
• 4.4.3 对香豆醛的黄嘌呤氧化酶抑制类型和抑制常数研究90-91
• 4.4.4 对香豆醛与别嘌呤醇的协同增效作用研究91-92
• 4.5 本章小结92-93
• 参考文献93-96
• 第五章 对香豆醛及其类似物的黄嘌呤氧化酶抑制活性构效关系的探讨96-118
• 5.1 前言96
• 5.2 实验材料与仪器96-98
• 5.2.1 试剂96-97
• 5.2.2 主要仪器设备97-98
• 5.3 实验方法98-101
• 5.3.1 黄嘌呤氧化酶抑制活性的测定98
• 5.3.2 分子对接98
• 5.3.3 对香豆醛及其衍生物的合成方法98-100
• 5.3.4 合成产物表征100
• 5.3.5 对香豆醛抑制黄嘌呤氧化酶机制的研究100
• 5.3.6 数据分析100-101
• 5.4 结果与讨论101-114
• 5.4.1 对香豆醛苯环上的基团对黄嘌呤氧化酶抑制活性影响的研究101-102
• 5.4.2 对香豆醛与黄嘌呤氧化酶的分子对接102-104
• 5.4.3 对香豆醛及其衍生物的合成104-109
• 5.4.4 对香豆醛及其衍生物的黄嘌呤氧化酶抑制活性及构效关系的探讨109-111
• 5.4.5 对香豆醛抑制黄嘌呤氧化酶机制的探讨111-114
• 5.5 本章小结114-115
• 参考文献115-118
• 结论与展望118-121
• 1. 结论118-119
• 2. 论文创新点119
• 3. 展望119-121
• 攻读博期间论文发表情况121-122
• 致谢122-124
• 附件124

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

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3 周瑾;刘俊;何娟娟;林峰;李淑慧;张瑞芹;;慢性高尿酸血症动物模型的制备及改良[J];深圳中西医结合杂志;2010年06期

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本文编号：325064