海洋来源免疫抑制剂Fumigaclavine C的发酵过程研究

发布时间：2017-05-09 14:17

  本文关键词：海洋来源免疫抑制剂Fumigaclavine C的发酵过程研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：麦角类生物碱Fumigaclavine C (FC)是由海蟹共生烟曲霉(Aspergillus fumigatus)中分离得到的一种次级代谢产物。文献报道它具有同临床一线用药环孢菌素A相当的抗炎免疫抑制活性,是一种潜在的免疫抑制剂候选药物。但FC较低的发酵水平制约了其进一步开发利用。为解决这一问题,本文拟通过对海蟹共生烟曲霉发酵生产FC的生物过程进行研究,探索不同发酵策略对海蟹共生烟曲霉生长及代谢过程的影响,建立针对FC生物合成特点的发酵工艺,进一步在反应器水平进行放大验证,为FC的规模化制备工艺开发奠定理论基础,并为FC后续的活性研究提供药源保障。本文首先基于麦角类生物碱与烟曲霉分生孢子间的相关性,建立了一种由液体振荡培养与静置培养相结合二阶段发酵工艺。在该工艺下,促进了海蟹共生曲霉在液态发酵中的分生孢子产量,并发现FC的生物合成与分生孢子形成在动力学上具有相关性。进一步采用Box-Behnken设计及响应面模型分析方法对二阶段发酵工艺进行优化,得到振荡培养及静置培养的最佳持续时间分别为4.5及8天,过程最优温度为28℃,在此条件下,FC最高产量可达62.7 mg/L,为文献报道最高值的3倍。在二阶段发酵工艺基础上,我们进一步考察了超声刺激对海蟹共生烟曲霉发酵过程的影响。发现在振荡培养阶段进行超声刺激同样能有效提高分生孢子的数量及FC的产量。通过单因素优化优化,得到适合FC生物合成的超声刺激条件为振荡培养12h后进行超声,超声持续10 min,每隔24 h超声一次直至静置发酵阶段开始。在此条件下,FC最高产量达到118.1 mg/L。进一步研究发现,超声能够通过提高底物利用效率及初级代谢水平,促进丙酮酸积累,从而提高FC产量。为了使FC的发酵工艺满足规模化生产要求,我们重新筛选了发酵培养基并考察了糖蜜作为FC生物合成廉价底物的可行性。结果发现,在培养基中添加糖蜜(100g/L)后,海蟹共生曲霉的产孢能力及FC生物合成得到了显著提高,并且降低了其他代谢产物的积累。通过对发酵过程的进一步优化,利用糖蜜制备种子液用于FC发酵,最终使FC最高产量达到226.9 mg/L。进一步研究发现,糖蜜能显著提升海蟹共生烟曲霉的代谢水平,促进丙酮酸积累并通过上调HMG-CoA还原酶(HMGR)活性来促进FC的生物合成。在完善了摇瓶水平FC发酵工艺之后,我们进一步将二阶段发酵工艺在反应器水平进行放大验证。利用搅拌釜反应器及静置反应器将二阶段发酵的振荡培养及静置培养阶段均成功在反应器水平再现。并分别利用桨叶末端线速度相似及单位体积发酵液气液接触面积(Agas-liq)相似的原则,将振荡培养及静置培养阶段均在反应器水平进行了放大。在不同反应器水平中FC的产量均能达到200 mg/L以上,成功再现了摇瓶中FC的发酵生产过程,为后续规模化发酵工艺的开发奠定了理论基础。
【关键词】：海蟹共生烟曲霉 Fumigaclavine C 分生孢子 二阶段培养 超声发酵 糖蜜
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ920.6
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第1章 绪论12-26
• 1.1 海洋来源药物研究现状12-15
• 1.2 海洋微生物及其天然产物15-17
• 1.2.1 海洋来源细菌15-16
• 1.2.2 海洋来源蓝细菌16
• 1.2.3 海洋来源真菌16-17
• 1.3 麦角类生物碱17-19
• 1.3.1 麦角类生物碱的生物活性17-18
• 1.3.2 麦角类生物碱的生产18-19
• 1.4 麦角类生物碱Fumigaclavine C(FC)的研究进展19-21
• 1.4.1 FC的生物活性19-20
• 1.4.2 FC的生物合成20-21
• 1.5 曲霉分生孢子的研究进展21-24
• 1.5.1 曲霉分生孢子的形成过程21-23
• 1.5.2 影响曲霉分生孢子形成的因素23-24
• 1.6 研究的目标、意义和具体研究内容24-26
• 1.6.1 研究的目标和意义24
• 1.6.2 具体研究内容24-26
• 第2章 二阶段培养对FC发酵过程的影响26-46
• 2.1 前言26
• 2.2 实验材料及方法26-36
• 2.2.1 试剂与仪器26-27
• 2.2.2 培养基27-29
• 2.2.3 菌株及培养条件29
• 2.2.4 二阶段发酵培养条件29
• 2.2.5 分析方法29-36
• 2.3 实验结果与讨论36-45
• 2.3.1 不同培养方式对海蟹共生烟曲霉菌体形态的影响36-37
• 2.3.2 不同培养方式对FC发酵过程的影响37-40
• 2.3.3 二阶段发酵工艺的响应面模型优化40-43
• 2.3.4 代谢途径调控对FC生物合成的影响43-45
• 2.4 本章小结45-46
• 第3章 超声刺激对FC发酵过程的影响46-60
• 3.1 前言46
• 3.2 实验材料及方法46-51
• 3.2.1 试剂与仪器46-47
• 3.2.2 培养基47-48
• 3.2.3 菌株及培养条件48
• 3.2.4 二阶段发酵培养条件48
• 3.2.5 分析方法48-51
• 3.3 结果与讨论51-59
• 3.3.1 超声刺激起始时间对FC发酵的影响51-52
• 3.3.2 超声刺激持续时间对FC发酵的影响52-53
• 3.3.3 超声刺激频度对FC发酵的影响53
• 3.3.4 超声刺激对FC的发酵过程的影响53-55
• 3.3.5 超声刺激对FC发酵过程菌体形态的影响55-57
• 3.3.6 超声刺激对FC发酵过程有机酸代谢的影响57-59
• 3.4 本章小结59-60
• 第4章 糖蜜对FC发酵过程的影响60-75
• 4.1 前言60
• 4.2 实验材料及方法60-64
• 4.2.1 试剂与仪器60-62
• 4.2.2 培养基62
• 4.2.3 菌株及培养条件62
• 4.2.4 二阶段发酵培养条件62
• 4.2.5 分析方法62-64
• 4.3 结果与讨论64-74
• 4.3.1 适合FC规模化生产的培养基筛选64-65
• 4.3.2 糖蜜对海蟹共生烟曲霉分生孢子形成及次级代谢的影响65-67
• 4.3.3 糖蜜浓度对FC发酵过程的影响67-70
• 4.3.4 糖蜜对FC发酵过程中有机酸代谢的影响70-71
• 4.3.5 糖蜜对FC发酵过程中HMG-CoA还原酶的影响71-72
• 4.3.6 利用糖蜜制备种子发酵液对FC发酵过程的影响72-74
• 4.4 本章小结74-75
• 第5章 FC发酵生产过程在反应器水平的放大验证75-85
• 5.1 前言75
• 5.2 实验材料及方法75-78
• 5.2.1 试剂与仪器75-76
• 5.2.2 培养基76
• 5.2.3 菌株及培养条件76-77
• 5.2.4 反应器水平发酵77-78
• 5.2.5 分析方法78
• 5.3 实验结果78-84
• 5.3.1 第一阶段发酵在反应器水平的工艺建立78-80
• 5.3.2 第二阶段发酵在反应器水平的工艺建立80-81
• 5.3.3 FC最优工艺下实验室规模反应器发酵81-83
• 5.3.5 FC中试规模反应器发酵放大验证83-84
• 5.4 本章小结84-85
• 第6章 结论与展望85-88
• 6.1 主要结论85-86
• 6.2 主要创新点86
• 6.3 展望86-88
• 参考文献88-98
• 致谢98-99
• 攻读博士期间的成果99

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