海湾扇贝酶解物的制备、鉴定及其体内外抗肿瘤作用研究
本文关键词：海湾扇贝酶解物的制备、鉴定及其体内外抗肿瘤作用研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：海洋生物提取物多具有抗肿瘤活性,扇贝是海洋生物的一种,由于其营养价值高且含有多种生理活性成分,因此在海洋抗癌药物研究中具有很好的应用和开发前景。本研究以海湾扇贝为原料,研究了海湾扇贝酶解物的制备、鉴定、抗肿瘤作用及其可能机制。主要研究结果如下:1.研究提出了海湾扇贝酶解物制备工艺条件,证明该酶解物具有较高的体外抗氧化活性。以去除内脏的海湾扇贝肉为原料,按固液比(g:m L)1:6.25加水匀浆,按1312.82U/g加入酸性蛋白酶,调节p H值到3.53,50℃恒温水解4 h,所得海湾扇贝酶解物的DPPH自由基清除率达到91.59%。进一步研究结果表明,10 mg/m L该酶解物的红细胞氧化溶血度(93.59%)与0.1 mg/m L Vc的红细胞氧化溶血度(96.63%)差异不显著,10 mg/m L该酶解物抗亚油酸过氧化能力(96.26%)显著高于1.0 mg/m L Vc(67.74%)和0.1 mg/m L Vc(40.65%)的抗亚油酸过氧化能力(P㩳0.05),说明该酶解物具有较高的抗氧化活性。2.测定了海湾扇贝酶解物的氨基酸组成及含量,鉴定了该酶解物中海湾扇贝多肽的一级结构。用柱前衍生反相高效液相色谱法测出海湾扇贝酶解物中包含14种游离氨基酸,多肽混合物中包含13种氨基酸,按含量由高到低依次为:精氨酸、半胱氨酸、组氨酸、苏氨酸、甘氨酸、脯氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸和亮氨酸。经串联飞行时间质谱法(MALDI TOF/TOF)鉴定,5个多肽组分的氨基酸序列分别为:组分1(m/z为706.3)Cys-Cys-Ser-His-Thr-Arg;组分2(m/z为718.3)Asn-Gly-Trp-Val-Thr-Arg;组分3(m/z为730.3)Gly-Asn-Pro-Met-Arg-Arg;组分4(m/z为741.4)Asp-His-Trp-Lys-Arg;组分5(m/z为908.5)Cys-Thr-Tyr-Gly-Pro-Val-Leu-Arg。3.研究了海湾扇贝酶解物对体外培养的两种肝癌细胞的影响,证明该酶解物的体外抗肿瘤效果。CCK-8法测出不同浓度海湾扇贝酶解物均能显著抑制人肝癌Hep G2和SMMC-7721细胞的生长(P0.01),且抑制率随酶解物浓度的升高而增加。其中,12mg/m L海湾扇贝酶解物组的抑制率分别为60.4%和64.2%,显著高于其他组的抑制率(P0.01);经倒置显微镜观察,该组两种细胞的形态较对照组均发生了明显改变,表现为细胞皱缩、透明度降低、细胞核固缩等,并出现了凋亡小体;经流式细胞仪分析,该组两种细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均显著升高(P0.01);p53蛋白阳性率均显著增高(P0.01),Bcl-2蛋白阳性率均显著降低(P0.01)。由此可知,海湾扇贝酶解物体外抗肿瘤的作用机制可能为:①通过上调p53蛋白表达,阻滞细胞周期,并经半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶途径诱导细胞凋亡;②通过线粒体通路下调Bcl-2蛋白表达,诱导细胞凋亡。4.研究了灌胃海湾扇贝酶解物对H22荷瘤小鼠的影响,证明该酶解物的体内抗肿瘤效果。对H22荷瘤小鼠灌胃不同剂量的海湾扇贝酶解物后,低剂量组(500 mg/Kg·d-1)、中剂量组(1000 mg/Kg·d-1)和高剂量组(1500 mg/Kg·d-1)的抑瘤率分别为28.16%、41.93%和84.00%,具有量效依赖趋势。与模型组相比,中剂量组小鼠血清中MDA和8-iso-PGF2α的水平显著降低(P0.05),SOD、IL-2、IL-12、GSH-Px和TNF-α的水平显著升高(P0.05);中剂量组小鼠肿瘤组织提取液中突变型p53、Survivin、MDA、8-OHd G和8-iso-PGF2α的水平显著降低(P0.05),SOD和GSH-Px的水平显著升高(P0.05)。肿瘤组织病理学观察也表明该酶解物有较好的抗肿瘤生物学效应。以上结果证明,海湾扇贝酶解物对小鼠肝癌H22具有明显的抑制作用,且中剂量组效果较优。由此可知,海湾扇贝酶解物体内抗肿瘤的作用机制可能为:①通过提高机体的抗氧化能力和免疫功能而发挥作用;②通过调控相关细胞因子的水平,间接诱导肿瘤细胞凋亡;③通过降低某些凋亡抑制蛋白和肿瘤标志蛋白的表达水平,抑制肿瘤的发生和发展。
【关键词】：海湾扇贝酶解物 氨基酸序列 抗肿瘤作用 H22荷瘤小鼠 肝癌细胞HepG2 肝癌细胞SMMC-7721
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS254.1
【目录】：
- 中文摘要6-8
- abstract8-14
- 1 引言14-26
- 1.1 目的意义14-15
- 1.2 国内外研究进展15-23
- 1.2.1 概述15-16
- 1.2.2 海洋贝类在保健食品和医药产业的利用现状16-17
- 1.2.3 海洋贝类酶解物及抗肿瘤活性肽研究进展17-19
- 1.2.4 海洋贝类活性肽制备技术研究进展19
- 1.2.5 海洋贝类活性肽分离纯化技术研究进展19-20
- 1.2.6 活性肽的构效关系研究进展20-21
- 1.2.7 海洋生物提取物抗癌作用机理21-23
- 1.3 主要研究内容及技术路线23-26
- 1.3.1 主要研究内容23-25
- 1.3.2 技术路线25-26
- 2 海湾扇贝酶解物制备及其体外抗氧化性研究26-42
- 2.1 材料与方法26-31
- 2.1.1 材料与试剂26
- 2.1.2 仪器设备26-27
- 2.1.3 试验方法27-30
- 2.1.4 试验设计30-31
- 2.1.5 试验结果统计方法31
- 2.2 结果与分析31-40
- 2.2.1 基本营养成分结果与分析31-32
- 2.2.2 单因素试验结果与分析32-34
- 2.2.3 响应面优化试验结果与分析34-39
- 2.2.4 体外抗氧化试验结果与分析39-40
- 2.3 讨论40-41
- 2.3.1 自由基清除率与抗肿瘤活性的关系40
- 2.3.2 固液比对酶解效果的影响40-41
- 2.4 小结41-42
- 3 海湾扇贝酶解物的组成分析及结构鉴定42-59
- 3.1 材料与方法42-46
- 3.1.1 材料与试剂42
- 3.1.2 仪器设备42-43
- 3.1.3 试验方法43-46
- 3.2 结果与分析46-57
- 3.2.1 海湾扇贝酶解物氨基酸组成及含量测定结果46-50
- 3.2.2 RP-HPLC分离结果50
- 3.2.3 海湾扇贝多肽的一级结构测定结果50-57
- 3.3 讨论57
- 3.3.1 氨基酸组成及含量对海湾扇贝酶解物功能的影响57
- 3.3.2 海湾扇贝多肽结构对其功能的影响57
- 3.4 小结57-59
- 4 海湾扇贝酶解物体外抗肿瘤活性及机制研究59-80
- 4.1 材料与方法59-62
- 4.1.1 材料与试剂59
- 4.1.2 仪器与设备59-60
- 4.1.3 试验方法60-62
- 4.2 结果与分析62-78
- 4.2.1 海湾扇贝酶解物对体外培养的肝癌细胞增殖的影响62-64
- 4.2.2 海湾扇贝酶解物对体外培养的肝癌细胞形态的影响64-68
- 4.2.3 海湾扇贝酶解物对体外培养的肝癌细胞凋亡的影响68-72
- 4.2.4 海湾扇贝酶解物对肿瘤细胞p53，Bcl-2 蛋白表达的影响72-78
- 4.3 讨论78-79
- 4.4 小结79-80
- 5 海湾扇贝酶解物体内抗肿瘤活性及其机制研究80-97
- 5.1 材料和方法80-84
- 5.1.1 试验材料80
- 5.1.2 试验仪器80
- 5.1.3 饲养方案及受试方案80-81
- 5.1.4 H22肝癌移植瘤动物模型的建立81
- 5.1.5 样品采集81-82
- 5.1.6 小鼠各检测指标的测定82-84
- 5.1.7 小鼠肿瘤组织病理学观察84
- 5.1.8 试验结果统计分析84
- 5.2 结果与分析84-93
- 5.2.1 灌胃海湾扇贝酶解物对小鼠体重的影响84-85
- 5.2.2 灌胃海湾扇贝酶解物对小鼠成瘤及生长情况的影响85-86
- 5.2.3 灌胃海湾扇贝酶解物对小鼠肿瘤抑制率的影响86
- 5.2.4 灌胃海湾扇贝酶解物对小鼠免疫器官指数的影响86-87
- 5.2.5 灌胃海湾扇贝酶解物对小鼠血清学指标的影响87-89
- 5.2.6 灌胃海湾扇贝酶解物对小鼠肿瘤组织提取液中各指标的影响89-90
- 5.2.7 肿瘤组织病理学观察90-93
- 5.3 讨论93-96
- 5.3.1 H22肝癌移植瘤动物模型的选择及建立93
- 5.3.2 海湾扇贝酶解物对荷瘤小鼠免疫器官的影响93-94
- 5.3.3 海湾扇贝酶解物对荷瘤小鼠抗氧化能力的影响94-95
- 5.3.4 海湾扇贝酶解物对荷瘤小鼠细胞因子的影响95
- 5.3.5 海湾扇贝酶解物对荷瘤小鼠中突变型p53 和生存素Survivin的影响95-96
- 5.4 小结96-97
- 6 结论与展望97-99
- 6.1 结论97-98
- 6.1.1 优化并确定了酶法提取海湾扇贝酶解物的工艺条件97
- 6.1.2 确定了海湾扇贝酶解物具有较高的体外抗氧化活性97
- 6.1.3 测定了海湾扇贝酶解物的氨基酸组成及含量97
- 6.1.4 鉴定了海湾扇贝多肽（PAI）的一级结构97
- 6.1.5 证明了海湾扇贝酶解物的体外抗肿瘤效果并预测了其机制97-98
- 6.1.6 证明了海湾扇贝酶解物的体内抗肿瘤效果并预测了其机制98
- 6.2 展望98-99
- 参考文献99-109
- 在读期间已发表和待发表的学术论文109-110
- 作者简历110-111
- 致谢111-112
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李咏梅;祝龙生;李人宇;;抑制氧化甲基橙光度法测定贝类中牛磺酸[J];现代食品科技;2014年04期
2 王俊丽;雒燕婷;郝光;闫潇;吴春;聂国兴;;地黄和小肽对鲤鱼生长性能及IL-8表达的调节[J];水产科学;2014年09期
3 刘亚,章超桦,张静;贝类功能性成分的研究现状及其展望[J];海洋科学;2003年08期
4 黄翠丽,刘赛;扇贝的生理活性物质和药用价值[J];中国海洋药物;2001年02期
5 黄绵庆,阎春玲,窦梅,战松梅,王美芝,王跃军,王春波;扇贝多肽对UVB损伤HaCaT细胞的抗氧化作用[J];中国海洋药物;2005年03期
6 张彩梅;刘晓萍;张红梅;于业军;程桂芹;;扇贝多肽对小鼠非特异性免疫功能的调节作用[J];中国海洋药物;2006年05期
7 樊洁;王岩;孙秀萍;韩彦_";王春波;;扇贝(Chlamys farreri)多肽通过EGFR抑制受紫外线B(UVB)诱导的HaCaT细胞凋亡[J];海洋与湖沼;2014年02期
8 杨永芳;丁国芳;杨最素;郁迪;郑玉寅;李荣;;紫贻贝酶解多肽体外抗肿瘤活性研究[J];浙江海洋学院学报(自然科学版);2011年02期
9 王龙;叶克难;;水产蛋白资源的酶解利用研究现状与展望[J];食品科学;2006年12期
10 唐道邦;裴小平;徐玉娟;吴继军;;响应曲面法优化鸡肉蛋白抗氧化肽制备工艺研究[J];食品科学;2010年06期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 叶俊丽;HSP70介导细胞氧化应激反应及扇贝多肽的神经保护作用研究[D];中国海洋大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前3条
1 孙霞;PCF经ROS/UCP2/cytoC信号通路对UVA诱导的HaCaT细胞凋亡的调控[D];中国海洋大学;2011年
2 于业军;扇贝多肽对中波紫外线氧化损伤的He La上皮细胞和小鼠皮肤保护作用的研究[D];青岛大学;2002年
3 韩彦_";扇贝多肽对UVA氧化损伤人真皮成纤维细胞和无毛小鼠皮肤的保护作用机制[D];青岛大学;2005年
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