金枪鱼在冷藏过程中鲜度变化及差异蛋白质组学研究

发布时间：2017-05-11 14:02

  本文关键词：金枪鱼在冷藏过程中鲜度变化及差异蛋白质组学研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：新鲜度是衡量水产品品质优劣的重要指标,对于建立有效的鲜度评价方法已成为食品科学领域中重要的研究内容。水产品鲜度下降是一个复杂的化学、物理、生化变化及微生物生长代谢的过程。其中蛋白质是引起水产品鲜度下降的最主要因素,但将蛋白质作为水产品鲜度评价方法的研究报道仍较少。近年来,蛋白质组学已经成为研究蛋白质的热门方法,尤其是差异蛋白组学,通过寻找、筛选和鉴定能表征水产品鲜度的指示蛋白,并全面及深入分析水产品新鲜度下降机理,旨在为水产品鲜度评价和控制提供新的思路和科学依据。因此,运用差异蛋白组学方法来研究水产品鲜度变化及作用机制具有十分重要的意义。鉴于此,本文以高经济价值和营养价值的远洋鱼类——大目金枪鱼作为研究对象,(1)采用传统品质评价方法(感官、微生物、化学和物理)系统分析金枪鱼在贮藏过程中品质变化规律,建立有效表征金枪鱼鲜度变化的综合评价模型,并确定鱼肉的货架期；(2)从蛋白质变性的角度出发,研究金枪鱼在贮藏过程中蛋白质的生化特性变化,筛选出适合金枪鱼的鲜度评价指标；(3)从蛋白质降解的角度出发,研究金枪鱼在冷藏过程中蛋白质降解规律,并分析蛋白质降解与鱼肉质构相关性,筛选出金枪鱼的鲜度评价指标,为鱼肉品质劣变机理的探讨提供理论依据和参考；(4)建立适合金枪鱼鱼肉的双向电泳凝胶体系,结合质谱技术和生物信息学手段分析鉴定差异蛋白质的结构和功能,筛选并鉴定金枪鱼冷藏过程中鲜度指示蛋白；(5)进一步结合实时荧光定量PCR对差异蛋白质的基因表达量进行分析,从基因水平验证其变化特性。主要研究结果如下：1.采用传统新鲜度评价方法,研究了金枪鱼在40C和15℃贮藏过程中品质变化。筛选出能反应金枪鱼在贮藏过程中鲜度评价指标有感官评定、TVB-N值、K值、硬度、弹性和a*/b*,pH值作为反应鱼肉鲜度的一个参考指标,而感官评定和微生物(嗜冷菌和嗜温菌)可进一步作为金枪鱼在贮藏过程中货架期判定依据；综合各指标得出金枪鱼在4℃和15℃组的货架期分别是4d和1.5d；利用因子分析了金枪鱼在不同贮藏条件下新鲜度品质变化,建立了其品质变化的综合评价模型,为全面分析其品质变化和新鲜度等级判断提供了参考和依据。2.在4℃和15℃贮藏过程中,金枪鱼鱼肉蛋白质生化特性发生了显著变化,表现在肌动球蛋白的盐溶性、总巯基及活性巯基含量和Ca2+-ATPase活性随着贮藏时间的延长,均呈下降趋势,而表面疏水性在贮藏初期阶段明显增加；总巯基和活性巯基含量可作为金枪鱼新鲜度的评价指标；且不同贮藏温度之间的蛋白质生化特性变化差异显著(P0.05),温度越低,蛋白质变性越缓慢,生化特性越稳定。3.4℃冷藏过程中,金枪鱼肌原纤维蛋白随着贮藏时间的延长而显著下降(P0.05),而碱溶性蛋白和TCA-可溶性肽含量则呈增加趋势；通过SDS-PAGE电泳结果表明,贮藏过程中金枪鱼鱼肉蛋白质发生了不同程度降解,降解最明显的是肌球蛋白重链；通过透射电镜观察发现,在贮藏6d时金枪鱼肌原纤维结构完全被破坏,Z线崩溃、M线和H区消失,肌节变长,肌原纤维间隙面积增大；蛋白质降解特性与鱼肉质构TPA的相关性分析,得出硬度、弹性均与肌原纤维蛋白、碱溶性蛋白、TCA-可溶性肽、肌球蛋白重链和肌动蛋白具有显著相关性(P0.01)；肌原纤维蛋白含量、TCA-可溶性肽和肌球蛋白重链可作为金枪鱼的新鲜度评价指标。4.采用24cm,pH4-7的IPG胶条建立了覆盖范围广、分辨率高、重复性好的金枪鱼鱼肉蛋白双向电泳图谱,并利用MALDI-TOF/TOF技术和NCBI数据库比对搜索方法成功鉴定了15个差异蛋白点(2个同源蛋白质),其中12个蛋白点表达量下调,他们分别是：肌球蛋白重链-1、6-磷酸果糖激酶、磷酸甘油酸激酶、丙酮酸激酶同工酶M型、烯醇化酶、p-烯醇化酶(2个)、磷酸丙糖异构酶、糖原磷酸化酶(2个)、肌球蛋白轻链-1、肌球蛋白轻链-3、α-肌动蛋白和β-肌动蛋白；Ⅰ型角蛋白S8的表达量上调。5.采用实时荧光定量PCR对冷藏过程中金枪鱼鱼肉蛋白质进行基因表达水平分析,进一步验证了金枪鱼中差异蛋白质的指示效果。研究表明,8个差异蛋白质被成功转录,其中冷藏过程中烯醇化酶、磷酸丙糖异构酶、肌球蛋白重链-1、a-肌动蛋白和p-肌动蛋白在mRNA水平与蛋白质表达变化水平趋势相一致。6.基于GO注释对于差异蛋白质进行生物信息学分析,结果表明可初步确定10种差异蛋白点作为金枪鱼新鲜度指示蛋白,且金枪鱼在冷藏过程中新鲜度指示蛋白主要通过2条途径导致鱼肉鲜度品质下降,具体机制如下：(1)通过糖酵解代谢途径影响金枪鱼鱼肉鲜度下降：冷藏过程中5种关于糖酵解反应的代谢酶,分别是6-磷酸果糖激酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸激酶、丙酮酸激酶和磷酸丙糖异构酶,且它们表达下调,表明随着冷藏时间延长代谢酶快速降解,糖酵解反应速率减慢。5种代谢酶在糖酵解反应起的调控作用,可作为金枪鱼新鲜度指示蛋白。(2)通过组织蛋白酶途径影响金枪鱼鱼肉鲜度下降：冷藏过程中5种关于肌原纤维结构蛋白质,分别是肌球蛋白重链-1、肌球蛋白轻链-1、肌球蛋白轻链-3、α-肌动蛋白和β-肌动蛋白,且它们表达下调,表明冷藏过程鱼肉中组织蛋白酶加快肌原纤维结构蛋白降解,破坏鱼肉组织结构,导致鱼肉新鲜度品质下降,由此可推测该5种结构蛋白质作为金枪鱼新鲜度指示蛋白。
【关键词】：大目金枪鱼 新鲜度 新鲜度指示蛋白 鱼肉蛋白质 差异蛋白质组学 荧光定量PCR
【学位授予单位】：浙江工商大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS254.4
【目录】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-12
• 缩略语表12-18
• 第一章 文献综述18-60
• 1.1 金枪鱼简介18-19
• 1.2 金枪鱼等水产品贮藏过程中鲜度变化及评价19-28
• 1.2.1 感官评定21-22
• 1.2.2 微生物评价22-23
• 1.2.3 化学评价23-26
• 1.2.4 物理评价26-28
• 1.3 金枪鱼等水产品在贮藏过程中蛋白质变化规律28-36
• 1.3.1 水产品中肌肉蛋白质组成及结构特征28-29
• 1.3.2 水产品中肌肉蛋白质生化特性的变化29-33
• 1.3.3 水产品中肌肉蛋白质降解变化及作用机制33-36
• 1.4 蛋白质组学及其在水产品品质和安全研究的应用36-44
• 1.4.1 蛋白质组学概念36-37
• 1.4.2 蛋白质组学研究体系37-40
• 1.4.3 蛋白质组学在水产品品质和安全研究的应用40-44
• 1.5 立题背景和主要研究内容44-48
• 1.5.1 立题背景44-45
• 1.5.2 主要研究内容和技术路线45-48
• 参考文献48-60
• 第二章 金枪鱼在贮藏过程中品质变化与综合评价研究60-91
• 2.1 前言60
• 2.2 实验材料与设备60-62
• 2.2.1 实验材料60-61
• 2.2.2 实验试剂61
• 2.2.3 主要仪器设备61-62
• 2.3 实验方法62-66
• 2.3.1 样品处理62
• 2.3.2 主要组成变化测定62
• 2.3.3 感官评定62-63
• 2.3.4 微生物评价63
• 2.3.5 化学评价63-65
• 2.3.6 物理评价65-66
• 2.3.7 数据处理66
• 2.4 实验结果与讨论66-84
• 2.4.1 主要组成变化分析66-68
• 2.4.2 感官评定68-69
• 2.4.3 微生物评价69-71
• 2.4.4 化学评价71-76
• 2.4.5 物理评价76-81
• 2.4.6 鲜度指标的因子分析81-84
• 2.5 本章小结84-85
• 参考文献85-91
• 第三章 金枪鱼贮藏过程中鱼肉蛋白质生化特性变化研究91-106
• 3.1 前言91
• 3.2 实验材料与设备91-92
• 3.2.1 实验材料91
• 3.2.2 实验试剂91
• 3.2.3 主要仪器设备91-92
• 3.3 实验方法92-95
• 3.3.1 样品处理92
• 3.3.2 肌动球蛋白的提取及盐溶性测定92-93
• 3.3.3 肌动球蛋白巯基含量测定93-94
• 3.3.4 肌动球蛋白Ca~(2+)-ATPase活性的测定94
• 3.3.5 肌动球蛋白表面疏水性测定94
• 3.3.6 数据处理94-95
• 3.4 实验结果与讨论95-101
• 3.4.1 肌动球蛋白盐溶性的变化95-97
• 3.4.2 总巯基和活性巯基含量的变化97-99
• 3.4.3 肌动球蛋白Ca~(2+)-ATPase活性的变化99-100
• 3.4.4 表面疏水性的变化100-101
• 3.5 本章小结101-103
• 参考文献103-106
• 第四章 金枪鱼冷藏过程中鱼肉蛋白质降解研究106-126
• 4.1 前言106
• 4.2 实验材料与设备106-107
• 4.2.1 实验材料106
• 4.2.2 实验试剂106-107
• 4.2.3 主要仪器设备107
• 4.3 实验方法107-111
• 4.3.1 样品处理107
• 4.3.2 鱼肉总蛋白质组成分析107-108
• 4.3.3 三氯乙酸(TCA)-可溶性肽的测定108-109
• 4.3.4 鱼肉蛋白质的SDS-PAGE分析109-110
• 4.3.5 肌原纤维蛋白的超微结构分析110-111
• 4.3.6 质构TPA测定111
• 4.3.7 数据处理111
• 4.4 实验结果与讨论111-122
• 4.4.1 蛋白质组成含量的变化111-113
• 4.4.2 TCA-可溶性肽含量的变化113-115
• 4.4.3 蛋白组分的SDS-PAGE分析115-118
• 4.4.4 肌原纤维蛋白的超微结构变化118-121
• 4.4.5 蛋白质降解与质构TPA之间相关性分析121-122
• 4.5 本章小结122-123
• 参考文献123-126
• 第五章 基于差异蛋白质组学研究金枪鱼冷藏过程中蛋白质变化126-156
• 5.1 前言126-127
• 5.2 实验材料与设备127-129
• 5.2.1 实验材料127
• 5.2.2 实验试剂127
• 5.2.3 主要仪器设备127-128
• 5.2.4 试剂配制128-129
• 5.3 实验方法129-138
• 5.3.1 样品处理129-130
• 5.3.2 双向电泳样品预处理130
• 5.3.3 双向电泳试验步骤130-135
• 5.3.4 差异蛋白质的质谱鉴定135-138
• 5.4 实验结果及讨论138-153
• 5.4.1 金枪鱼蛋白质双向电泳技术体系建立138-140
• 5.4.2 金枪鱼在冷藏过程中鱼肉总蛋白点变化140-141
• 5.4.3 金枪鱼冷藏过程中肌肉差异表达蛋白点变化141-149
• 5.4.4 金枪鱼冷藏过程中差异蛋白点的质谱鉴定结果149-151
• 5.4.5 讨论151-153
• 5.5 本章小结153-154
• 参考文献154-156
• 第六章 金枪鱼冷藏过程中差异蛋白质基因表达变化的研究156-174
• 6.1 前言156
• 6.2 实验材料和仪器156-157
• 6.2.1 实验材料156-157
• 6.2.2 实验试剂157
• 6.2.3 主要仪器设备157
• 6.3 实验方法157-161
• 6.3.1 样品处理157
• 6.3.2 差异表达蛋白的RT-PCR转录水平鉴定157-161
• 6.3.3 试验流程161
• 6.3.4 数据处理161
• 6.4 实验结果及讨论161-170
• 6.4.1 金枪鱼冷藏过程中差异蛋白点RT-PCR鉴定161-167
• 6.4.2 差异表达蛋白的双向电泳组和实时荧光定量PCR的比较167-168
• 6.4.3 讨论168-170
• 6.5 本章小结170-171
• 参考文献171-174
• 第七章 差异蛋白质影响金枪鱼鲜度下降的机理分析174-189
• 7.1 前言174
• 7.2 金枪鱼冷藏过程中差异蛋白质的功能分类174-179
• 7.2.1 差异蛋白质的生物功能分类174-176
• 7.2.2 差异蛋白质的细胞组成分类176-177
• 7.2.3 差异蛋白质的分子功能分类177-179
• 7.3 差异蛋白质的生物信息学分析179-183
• 7.3.1 能量代谢相关蛋白生物信息学分析179-181
• 7.3.2 肌纤维结构相关蛋白的生物信息学分析181-183
• 7.3.3 纤维状蛋白质生物信息学分析183
• 7.4 差异蛋白质影响金枪鱼新鲜度下降机理分析183-186
• 7.4.1 通过糖酵解代谢途径影响金枪鱼新鲜度下降183-185
• 7.4.2 通过组织蛋白酶途径影响金枪鱼新鲜度下降185-186
• 7.5 本章小结186-187
• 参考文献187-189
• 总结论、创新点和研究展望189-192
• 总结论189-191
• 创新点191
• 研究展望191-192
• 附录一 图表192-205
• 附录二 博士期间发表的论文205-206
• 致谢206-207

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 刘卫群;李浩;;差异蛋白质组学在植物研究中的应用[J];安徽农业科学;2006年17期

2 殷仁富,张国元,陈思聪,过家珞,仇韶华,史文君,许绍辉,孔宪涛;人肌肉β-烯醇化酶的分离纯化及抗体制备[J];第二军医大学学报;1992年03期

3 方竞;鱼肉蛋白质冷冻变性机理、测定方法及防止措施[J];福建水产;2001年03期

4 马莉;谢秀兰;岳华;;鸡β-actin基因实时荧光定量PCR方法的建立[J];中国畜牧兽医;2007年02期

5 路昊;包建强;;因子和相关性分析在黄鳍金枪鱼腹部肌肉理化分析与感官鉴定的相关比较中的应用[J];现代食品科技;2007年07期

6 荣建华;甘承露;丁玉琴;赵思明;熊善柏;;低温贮藏对脆肉鲩鱼肉肌动球蛋白特性的影响[J];食品科学;2012年14期

7 张婷;吴燕燕;李来好;王雅楠;任中阳;;咸鱼品质的质构与感官相关性分析[J];水产学报;2013年02期

8 刘书臣;廖明涛;赵巧灵;林森森;戴志远;;不同贮藏温度下大目金枪鱼鲜度及组胺变化[J];食品与发酵工业;2013年05期

9 李立,李金强,钟响;反相分配离子对色谱法快速测定鱼肉中的组胺[J];检验检疫科学;2001年04期

10 李玉保;鲍恩东;王志亮;赵茹茜;;荧光定量RT-PCR法检测运输应激猪热休克蛋白mRNA转录水平[J];中国农业科学;2006年01期

中国博士学位论文全文数据库 前3条

1 蒋昊;中国明对虾在胁迫条件下肝胰脏的差异蛋白质组学研究[D];中国科学院研究生院（海洋研究所）;2009年

2 徐永杰;猪肌肉组织差异蛋白质组学研究[D];华中农业大学;2010年

3 沈瑾;电刺激处理牛肉的差异蛋白质组学研究[D];山东农业大学;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 胡会永;小分子化合物木脂素VB6通过激活JNK信号通路诱导肿瘤细胞凋亡和自噬的机制研究[D];浙江大学;2012年

  本文关键词：金枪鱼在冷藏过程中鲜度变化及差异蛋白质组学研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：357372