透明颤菌血红蛋白及其突变体蛋白对芳香族污染物清除作用的实验研究

发布时间：2017-05-21 08:09

  本文关键词：透明颤菌血红蛋白及其突变体蛋白对芳香族污染物清除作用的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着社会经济和生产力的不断发展,工业三废的无节制排放、粉尘和酸雨的侵蚀、化肥农药杀虫剂的大量施用等,大量的污染物被排放到空气、土壤和水中。但是,自然界对这些污染物的降解能力有限,水中的芳香族化合物及有机营养物的增多,导致水生动物变异,灭绝。我国野生动物生境中苯系物的污染非常广泛,对水生生境中的野生动物造成了严重的危害。目前,对水污染的处理主要可分为三类：物理法、化学法和生物法,生物法又包括微生物法和生物酶法。国内使用生物酶法清除苯系物的研究尚处于起步阶段。生物酶法是利用酶的催化作用来加速清除有机物的方法,过氧化物酶类就是生物酶法中的一种能清除水中污染的酶。2002年Bhunia等发现,染料对辣根过氧化物酶的抑制作用导致天然过氧化物酶对亚甲基兰及苯酚的清除速率较低。如何解决这一问题呢?这在酶来源上对我们提出了挑战。透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin, VHb)是一个来源于专性好氧的Vitreoscilla中的细菌球蛋白。近期研究发现它具有类过氧化物酶活力,透明颤菌血红蛋白可以催化各种芳香族类的底物。因此透明颤菌血红蛋白作为类过氧化物酶在水污染治理中具有很大的应用潜力。为此,开展了下述实验研究：1.将含有透明颤菌血红蛋白质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)在低氧条件下进行表达。SDS-凝胶电泳在14.3KD左右的电泳亮带表明透明颤菌血红蛋白己被成功表达。细胞破碎液经过硫酸铵沉淀、离子交换层析、分子筛柱层析等纯化步骤后,制备的透明颤菌血红蛋白的紫外特征吸收峰在402nm及280nm处,Rz值大于3.0。将得到的透明颤菌血红蛋白通过铁氰化钾氧化,进行全氧化态的制备,紫外吸收光谱证实了上述样品的全氧化态。2.为探索透明颤菌血红蛋白不同突变体对苯系物污染物(不同底物)的选择性和清除效率,进一步设计了透明颤菌血红蛋白突变体Q53H, P54C, Q53H/P54C并纯化制备了相应的蛋白。差热分析等实验表明,透明颤菌血红蛋白突变体Q53H/P54C蛋白的熔化温度(热稳定性)高于辣根过氧化物酶、透明颤菌血红蛋白和透明颤菌血红蛋白突变体(Q53H、P54C)蛋白。3.鉴于亚甲基兰是纺织工业废水中常见的污染物质,为此我们优化了透明颤菌血红蛋白及其突变体蛋白(Q53H, P54C, Q53H/P54C)在不同PH、温度和H202浓度下的亚甲基兰清除效率。结果表明：在pH 7.5, H2O2 7.5 mM的条件下,透明颤菌血红蛋白清除亚甲基兰的效率比辣根过氧化物酶高5.7倍,而透明颤菌血红蛋白突变体Q53H/P54C对亚甲基兰的清除率比透明颤菌血红蛋白高1.4倍；与辣根过氧化物酶相比较,透明颤菌血红蛋白突变体Q53H/P54C具有更好的热稳定性、更佳的pH稳定性和H202抗性。认为经定点突变后透明颤菌血红蛋白突变体清除效率的增高暗示着将透明颤菌血红蛋白远端口袋E7位置的谷氨酰胺替换为组氨酸后,引入的组氨酸将导致螺旋含量的增加,这将导致组氨酸被推向血红素平面,使得卟啉周围的结构更靠近反应部位。4.苯胺、三氯苯胺、苯酚、三氯苯酚是苯系物中有代表性的工农业生产和人类生活污染的排放物。针对不同的底物,在优化最适pH及最适温度的基础上,比较透明颤菌血红蛋白及其突变体Q53H, P54C, Q53H/P54C对不同苯系物清除效率上的差异。实验结果表明：在以苯胺、2,4,5-三氯苯胺、苯酚为底物时,透明颤菌血红蛋白突变体Q53H表现出最高的清除效率；在以三氯苯酚为底物时,透明颤菌血红蛋白突变体P54C表现出最高的清除效率。说明透明颤菌血红蛋白远端口袋位置经分子改造后,能改善其对不同苯系物底物的选择性。在处理含有苯系物的污水时,可针对不同的底物,选用清除效率最佳的突变体进行治理。综上所述,本研究在分子水平上对透明颤菌血红蛋白及其突变体P54C, Q53H, Q53H/P54C蛋白对动物生境中的可能污染物亚甲基兰,芳香族有机化合物苯酚、苯胺、2,4,5-三氯苯胺和2,4,6-三氯苯酚的清除作用进行了探索。通过定点突变的技术,改变了透明颤菌血红蛋白血卟啉周围的蛋白质结构和构象,这一变化可能改变配基对血卟啉的亲和力,从而改善透明颤菌血红蛋白对底物的催化活力。获得了对亚甲基兰具有更高清除效率的Q53H/P54C突变体,对苯酚、苯胺、2,4,5-三氯苯胺具有更高清除效率的Q53H突变体,以及对2,4,6-三氯苯酚具有更高清除效率的P54C突变体。透明颤菌血红蛋白是微生物来源的类过氧化物酶,在来源方面广泛,成本低,污水中的一些污染物也不会对其造成抑制作用。因此透明颤菌血红蛋白作为过氧化物酶在水污染中具有很大的开发价值,可以为野生动物生境中的苯类污染物清除的新方法建立奠定基础。
【关键词】：生境 透明颤菌血红蛋白 过氧化物酶 芳香族污染物
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：X703
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 1 绪论12-27
• 1.1 动物生境中污染物及其危害12-14
• 1.1.1 空气中的污染物及危害12
• 1.1.2 土壤中的污染物及危害12-13
• 1.1.3 水环境中的污染物与影响13-14
• 1.2 水生生境污染物的清除方法14-16
• 1.2.1 物理法15
• 1.2.2 化学法15
• 1.2.3 生物法15-16
• 1.3 野生动物生境中污染物的清除——生物酶法16-19
• 1.3.1 酶16
• 1.3.2 过氧化物酶16-17
• 1.3.3 过氧化物酶特点和应用17-19
• 1.4 透明颤菌血红蛋白过氧化物酶19-24
• 1.4.1 透明颤菌19-20
• 1.4.2 透明颤菌血红蛋白20-22
• 1.4.3 透明颤菌血红蛋白的功能22-23
• 1.4.4 透明颤菌血红蛋白的应用23-24
• 1.5 研究目的、意义、内容、技术路线及创新点24-27
• 1.5.1 研究的目的和意义24-25
• 1.5.2 研究内容及技术路线25
• 1.5.3 课题的创新点25-27
• 2 透明颤菌血红蛋白制备27-36
• 2.1 实验材料和实验药品27-29
• 2.1.1 实验材料27
• 2.1.2 实验药品27-28
• 2.1.3 实验仪器28-29
• 2.2 实验方法29-32
• 2.2.1 大肠杆菌BL21(DE3)感受态的制备29
• 2.2.2 透明颤菌血红蛋白质粒的转化29-30
• 2.2.3 透明颤菌血红蛋白的质粒提取30
• 2.2.4 透明颤菌血红蛋白大肠杆菌的表达30
• 2.2.5 透明颤菌血红蛋白的纯化30-32
• 2.3 实验结果与讨论32-34
• 2.3.1 透明颤菌血红蛋白的制备32
• 2.3.2 透明颤菌血红蛋白纯度的验证32-34
• 2.3.3 透明颤菌血红蛋白氧化态的制备34
• 2.4 本章小结34-36
• 3 透明颤菌血红蛋白突变体制备36-43
• 3.1 实验材料和实验药品36-37
• 3.1.1 实验材料36
• 3.1.2 实验药品36
• 3.1.3 实验仪器36-37
• 3.2 实验方法37
• 3.2.1 透明颤菌血红蛋白突变体质粒的转化37
• 3.2.2 透明颤菌血红蛋白突变体的质粒提取37
• 3.2.3 透明颤菌血红蛋白突变体的表达与纯化37
• 3.2.4 透明颤菌血红蛋白突变体氧化态的制备37
• 3.3 实验结果37-42
• 3.3.1 透明颤菌血红蛋白突变体纯度的验证37-40
• 3.3.2 透明颤菌血红蛋白突变体氧化态的制备40-42
• 3.4 本章小结42-43
• 4 透明颤菌血红蛋白及突变体对亚甲基蓝的清除43-53
• 4.1 透明颤菌血红蛋白及突变体的过氧化物酶活性43-45
• 4.1.1 透明颤菌血红蛋白及突变体的浓度检测43
• 4.1.2 基本酶活性的检测43-44
• 4.1.3 亚甲基蓝的清除44-45
• 4.2 结果与讨论45-52
• 4.2.1 透明颤菌血红蛋白及突变体的浓度检测45
• 4.2.2 透明颤菌血红蛋白及突变体的过氧化物酶活性45-46
• 4.2.3 亚甲基蓝的清除46-52
• 4.3 本章小结52-53
• 5 透明颤菌血红蛋白及突变体对生境中苯系物的清除53-67
• 5.1 苯胺的清除53-54
• 5.1.1 温度对苯胺的清除影响53-54
• 5.1.2 不同pH对苯胺的清除影响54
• 5.1.3 苯胺的清除效率54
• 5.2 苯酚的清除54
• 5.2.1 温度对苯酚的清除影响54
• 5.2.2 不同pH对苯酚的清除影响54
• 5.2.3 苯酚的清除效率54
• 5.3 2,4,6-三氯苯酚的清除54-55
• 5.3.1 温度对2,4,6-三氯苯酚的清除影响54-55
• 5.3.2 不同pH对2,4,6-三氯苯酚的清除影响55
• 5.3.3 2,4,6-三氯苯酚的清除效率55
• 5.4 2,4,5-三氯苯胺的清除55
• 5.4.1 温度对2,4,5-三氯苯胺的清除影响55
• 5.4.2 不同pH对2,4,5-三氯苯胺的清除影响55
• 5.4.3 2,4,5-三氯苯胺的清除率55
• 5.5 结果与讨论55-65
• 5.5.1 苯系污染物紫外分光光度计波长的选取及生成物摩尔消光系数55-57
• 5.5.2 污染物苯胺、苯酚、2,4,5-三氯苯胺和2,4,6-三氯苯酚的清除57-65
• 5.6 本章小结65-67
• 6 展望67-68
• 结论68-69
• 参考文献69-79
• 攻读学位期间发表的学术论文79-80
• 致谢80-81

【参考文献】

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本文编号：383054