农产品中黄曲霉毒素新型免疫分析技术研究

发布时间：2017-05-30 10:10

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【摘要】：黄曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)是主要由黄曲霉和寄生曲霉产生,自然分布极为广泛的一类毒性超强的化合物,也是目前公认的最强的致癌物质,世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构(IARC)于1993年将黄曲霉毒素划分为Ⅰ类致癌物。受黄曲霉毒素污染的农产品严重威胁消费者身体健康与生命安全。因此,开发针对这类致癌物的检测技术,为农产品和食品安全提供技术保障就变得十分重要。近几十年来,多种黄曲霉毒素的检测技术被开发出来,其中有HPLC,LC-MS/MS,以及免疫分析法等等。在这些方法中,免疫分析方法因为具有灵敏度高,特异性强,检测成本低廉等优点而成为检测领域的一个新兴热点研究方向。近些年来,本实验室先后成功开发了黄曲霉毒素荧光增强免疫亲和检测技术、黄曲霉毒素纳米金免疫层析检测技术和黄曲霉毒素铕时间分辨荧光免疫层析检测技术,并在农产品和食品等检测领域得到了广泛应用。随着技术的革新与进步,一些新的免疫分析技术也被不断开发出来。比如非标记免疫分析技术,只需要一步反应就可以完成检测,是一种直接、省时的检测方法;又比如免疫PCR技术,它是一种新型的免疫检测技术,能将ELISA的诸多优点与PCR扩增技术相结合,有着更高的灵敏度与更宽的线性范围;还有环介导的等温扩增技术,它是最近几年才被开发出来的新型的核酸扩增技术,比传统的PCR更灵敏,扩增效率更高,并且不需要特殊的仪器设备。本研究以实验室已经研制的抗黄曲霉单克隆抗体1C11以及抗独特型纳米抗体噬菌体V2-5为基础,建立了三种新型的免疫分析方法,为农产品中黄曲霉毒素的检测带来了新的思路与技术平台。本研究的主要内容与创新点如下:1.首次发现了黄曲霉毒素荧光免疫淬灭现象,并据此研究建立了基于抗体诱导荧光淬灭效应的黄曲霉毒素非标记免疫分析技术,该方法快捷,简单,成本低廉,只需要一步反应便可完成检测,有着十分广阔的应用前景。基于特异性免疫结合反应诱导的荧光淬灭效应,我们建立了一种简单,直接,非标记的免疫分析方法。作为模型分析物的AFB1,其内荧光能够被特异性的抗AFB1单克隆抗体淬灭,这种荧光淬灭效应被用来定量检测AFB1。AFB1的荧光值先被2,6-二甲基-β-环糊精增强,然后抗AFB1抗体1C11被加入到混合物里面,进行免疫反应。荧光扫描结果表明,在10%的甲醇水溶液中,与1C11反应完毕后,AFB1的荧光值明显地下降了。在最优参数的基础上,这种直接非标记的免疫分析技术被用来定量检测AFB1。我们建立了淬灭标准曲线,标准曲线有着很好的线性与相关性,R2=0.9998,线性范围为1-20 ng/m L,检测限为0.35ng/m L。本方法与HPLC进行了对比,结果表明本方法的回收率与HPLC的回收率相符,说明本方法能够应用于花生样品中AFB1的检测。综上,这种基于荧光淬灭效应的非标记免疫分析技术,可以被广泛应用于AFB1及其他有内荧光的物质的免疫检测。与传统的免疫分析方法相比,本方法十分简便并且省时;另外,本方法由于不需要剧毒的抗原,因此对环境十分友好,可以减少对操作人员健康的影响,并且节省检测成本。2.首次建立了基于荧光定量PCR的黄曲霉毒素免疫分析技术,并应用于花生、大米、玉米、饲料样品的实际检测,将原方法的灵敏度提升了4倍,给黄曲霉毒素的检测带来新的思路和发展方向。本研究利用抗黄曲霉毒素独特型纳米抗体噬菌体,设计了针对其编码纳米抗体基因序列的特异性引物,建立了基于荧光定量PCR的黄曲霉毒素免疫分析技术。这种新型的免疫分析技术能够把ELISA的诸多优点与PCR扩增技术整合起来。本方法的检测限为0.02 ng/m L,相比传统的噬菌体ELISA而言,灵敏度提升了4倍,另外,本方法的线性范围也更宽。本方法成功地应用到了花生、大米、玉米、饲料这四种黄曲霉毒素主要污染样品的检测中,添加回收率为77.05-122.16%。为了进一步验证本方法,将检测结果与HPLC方法进行了对比,在玉米和花生样品中,两种方法的相关性为0.991,说明两种方法有着很好的一致性。本研究表明,抗独特型纳米抗体噬菌体可以用来建立针对小分子污染物的高灵度荧光定量PCR检测技术,这也是荧光定量PCR方法首次应用于农产品中黄曲霉毒素的免疫检测。另外,基于重组噬菌体的这种独特的生物学特性,可以通过它建立农产品中多种真菌毒素的同步检测技术。3.建立了以环介导等温扩增技术为基础的黄曲霉毒素免疫分析方法,并应用于花生样品中黄曲霉毒素的检测,该方法简单、快捷、灵敏、经济且不需要大型仪器辅助,为黄曲霉毒素的现场快速检测提供了新的选择方案。基于抗体1C11与纳米抗体噬菌体V2-5,我们建立了基于环介导等温扩增(LAMP)的黄曲霉毒素免疫检测技术。LAMP反应在0.2 m L的PCR管中进行,反应体系由以下几种成份组成:d NTPs,甜碱,Mg SO4,p H8.8 Tris-HCl,KCl,(NH4)2SO4,Tween-20,DNA模版,四种特异引物(B3,F3,FIP,BIP)以及Bst DNA聚合酶。反应流程是将PCR管置于63 oC的恒温水浴锅中40min,然后于95 oC恒温2 min,使酶失活以终止反应。该方法用于检测黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检测限分别为:0.1 ng/m L、0.1 ng/m L、0.2 ng/m L、1 ng/m L。免疫LAMP技术原理是将竞争的免疫反应与LAMP方法相结合,该方法的检测结果可以直接用肉眼判定,当指示剂颜色为紫罗兰时,为阳性结果,当指示剂为天蓝色时,为阴性结果。以花生样品为代表,将免疫LAMP方法与HPLC进行了对比,两种方法的结果一致。综上可知,免疫LAMP方法不需要大型仪器辅助,是一种简单、快捷、灵敏且经济的检测方法,并可以应用于农产品中黄曲霉毒素的免疫检测。
【关键词】：黄曲霉毒素 非标记免疫分析 荧光淬灭 荧光定量PCR 环介导等温扩增
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS207.3
【目录】：

• 摘要5-7
• abstract7-18
• 英文缩略表18-20
• 第一章 引言20-41
• 1.1 农产品小分子污染物免疫检测技术概述20-29
• 1.1.1 农产品小分子污染物概述20
• 1.1.2 小分子污染物免疫检测技术20-29
• 1.2 黄曲霉毒素免疫检测技术研究现状29-36
• 1.2.1 黄曲霉毒素概述29-33
• 1.2.2 黄曲霉毒素免疫检测技术研究现状33-36
• 1.3 黄曲霉毒素免疫检测技术发展趋势36-41
• 1.3.1 绿色免疫分析方法36-37
• 1.3.2 非标记的免疫分析方法37
• 1.3.3 黄曲霉毒素纳米抗体技术37-39
• 1.3.4 免疫分析方法与PCR方法的联用39-40
• 1.3.5 免疫分析方法与环介导等温扩增方法的联用40-41
• 第二章黄曲霉毒素免疫荧光淬灭效应及分析方法研究41-65
• 2.1 引言41
• 2.2 材料41-45
• 2.2.1 仪器及耗材41-42
• 2.2.2 主要试剂42-43
• 2.2.3 杂交瘤细胞株及实验动物43
• 2.2.4 主要缓冲液及培养基43-45
• 2.3 方法45-49
• 2.3.1 抗体制备及纯化45-47
• 2.3.2 AFB1荧光及淬灭效应47-48
• 2.3.3 荧光增强剂的选择48
• 2.3.4 基于荧光淬灭效应AFB1免疫分析方法的建立48-49
• 2.3.5 基于荧光淬灭效应AFB1免疫分析方法在样品分析中的应用49
• 2.4 结果49-62
• 2.4.1 抗体纯化效果鉴定49-51
• 2.4.2 AFB_1的自身荧光强度51-52
• 2.4.3 AFB_1的荧光淬灭效应52-53
• 2.4.4 三种荧光增强剂的荧光增强效果53-55
• 2.4.5 荧光增强剂的选择55-56
• 2.4.6 基于荧光淬灭效应AFB1免疫分析方法的建立56-60
• 2.4.7 样品添加回收测定60-61
• 2.4.8 与HPLC方法进行结果对比61-62
• 2.5 讨论62-64
• 2.5.1 荧光增强剂的选择62-63
• 2.5.2 抗体对黄曲霉毒素荧光淬灭机理63-64
• 2.5.3 基于荧光淬灭效应的黄曲霉毒素免疫分析方法应用前景64
• 2.6 小结64-65
• 第三章黄曲霉毒素实时荧光定量PCR免疫分析方法研究65-89
• 3.1 引言65-66
• 3.2 材料66-68
• 3.2.1 仪器及耗材66
• 3.2.2 主要试剂66-67
• 3.2.3 抗体和菌株67
• 3.2.4 主要缓冲液和培养基67-68
• 3.3 方法68-73
• 3.3.1 纳米抗体噬菌体V2-5 的扩增68-70
• 3.3.2 荧光定量PCR参数优化70-71
• 3.3.3 黄曲霉毒素实时荧光定量PCR免疫分析方法的建立71-72
• 3.3.4 黄曲霉毒素实时荧光定量PCR免疫分析方法在样品检测中的应用72-73
• 3.4 结果73-85
• 3.4.1 纳米抗体噬菌体V2-5 的ELISA鉴定73
• 3.4.2 荧光定量PCR参数优化73-77
• 3.4.3 黄曲霉毒素实时荧光定量PCR免疫分析方法的建立77-80
• 3.4.4 黄曲霉毒素实时荧光定量PCR免疫分析方法在样品检测中的应用80-85
• 3.5 讨论85-88
• 3.5.1 抗独特型纳米抗体噬菌体的优点85-87
• 3.5.2 黄曲霉毒素实时荧光定量PCR免疫分析方法灵敏度87
• 3.5.3 基质效应87
• 3.5.4 黄曲霉毒素实时荧光定量PCR免疫分析方法应用前景87-88
• 3.6 小结88-89
• 第四章黄曲霉毒素环介导等温扩增免疫分析方法研究89-104
• 4.1 引言89
• 4.2 材料89-91
• 4.2.1 仪器及耗材89-90
• 4.2.2 主要试剂90
• 4.2.3 抗体和菌株90
• 4.2.4 主要缓冲液和培养基90-91
• 4.3 方法91-94
• 4.3.1 纳米抗体噬菌体V2-5 的扩增91
• 4.3.2 引物的设计与选择91-93
• 4.3.3 反应条件的优化93
• 4.3.4 LAMP目视检测方法93-94
• 4.3.5 黄曲霉毒素LAMP免疫分析方法的建立94
• 4.4 结果94-101
• 4.4.1 引物的筛选94-95
• 4.4.2 引物特异性测试95-96
• 4.4.3 反应条件的优化96-98
• 4.4.4 LAMP目视检测方法98-99
• 4.4.5 黄曲霉毒素LAMP免疫分析方法的建立99-101
• 4.5 讨论101-103
• 4.5.1 LAMP引物设计101-102
• 4.5.2 LAMP目视检测指示剂的选择102
• 4.5.3 黄曲霉毒素LAMP免疫分析方法的灵敏度102-103
• 4.5.4 黄曲霉毒素LAMP免疫分析方法的应用前景103
• 4.6 小结103-104
• 第五章全文结论104-106
• 参考文献106-116
• 致谢116-117
• 作者简历117

【参考文献】

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