甲基丙烯酸酯类高性能基因载体的构建、制备与表征

发布时间：2017-06-05 05:12

  本文关键词：甲基丙烯酸酯类高性能基因载体的构建、制备与表征，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着人类社会的发展,遗传性疾病、癌症以及心血管疾病等重大疾病的发病率逐年上升,严重威胁人类的健康,传统的医疗手段很难彻底治愈这些疾病,基因治疗利用将外源正常基因导入靶细胞的方式为这些疾病开辟了新的治疗手段。目前,制约基因治疗的关键是缺乏既安全又高效的基因载体,由于病毒载体的安全性较差,人们的研究重心转向了非病毒基因载体的研制,而目前研究最广泛的非病毒基因载体是阳离子聚合物。原子转移自由基聚合(ATRP)是一种活性可控的聚合方法,其反应温度适中、适用单体种类多,非常适用于制备多功能的阳离子聚合物。本论文根据目前非病毒基因载体材料的发展趋势,针对载体转染效率低且毒性高的科学问题,在ATRP法的基础上制备了一系列高性能的甲基丙烯酸酯类阳离子基因载体,通过细胞实验和动物实验评价了载体的基因转染效率,对促进安全高效的非病毒基因载体的研制具有重要意义。乙醇胺(EA)功能化的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)衍生物基因载体(PGEA)由于含有丰富的仲胺和羟基基团,在不同的细胞系中,具有较高的转染效率和较低的细胞毒性。我们利用低分子量的PGEA对花-3,4,9,10-四羧酸二酰亚胺(PBI)进行修饰,制备出一种带有荧光成像功能的双功能阳离子基因载体(PBI-PGEA)。这种载体材料在不同的细胞系中均能表现出较高的基因转染效率。此外,PBI-PGEA能够在2-5分钟内快速有效地完成对细胞的染色,并且在染色过程中不会产生明显的细胞毒性,避免了对细胞可能产生的副反应。根据相关报道,生物还原性的引入会提高基因载体的转染效率。本论文中,我们利用天然多糖Pullulan的肝细胞特异性以及具有生物还原性的双硫键,通过ATRP法成功地制备了具有良好生物相容性的可剪切的肝靶向性梳状阳离子基因载体,首先在普鲁兰的羟基上引入含有可生物还原双硫键的ATRP引发位点,随后通过ATRP反应引入PGMA侧链,最后通过醇胺(EA)功能化合成以普鲁兰多糖为骨架,可生物还原的肝靶向性梳状阳离子基因载体PuPGEA。该载体材料不仅具有优于阳离子基因载体的国际金标PEI的基因转染效率和细胞毒性,而且通过在不同细胞内吞抑制剂存在的情况下进行基因转染测试,发现PuPGEA系列载体材料具有肝细胞靶向性,通过溶血性测试,发现PuPGEA系列载体材料具有极好的血液相容性。在制备了具有较高转染效率和较低细胞毒性载体的基础上,我们又制备出了一种既能够传递基因又能够运送抗癌药物的双功能基因载体。首先利用简单的两步法在氧化石墨烯表面引入含有双硫键的ATRP引发位点,随后在其表面可控地引发甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)聚合,制备一系列有机-无机杂化产物(SS-GPD),通过X射线光电子能谱(XPS)和原子力显微镜(AFM)表征氧化石墨烯以及SS-GPD纳米颗粒。与纯的氧化石墨烯片层和PDMAEMA均聚物相比,SS-GPD系列载体材料表现出更好的DNA缩合能力,更低的细胞毒性以及更高的转染效率。此外,氧化石墨烯片层可与带芳香环的抗癌药物10-羟基喜树碱(CPT)形成共轭结构,通过对细胞进行活性测试,发现SS-GPD系列材料可以很好地将药物运送到细胞内,因此其可被作为潜在的药物载体。心血管疾病是一直以来都是人类健康的头号杀手,居各种死亡原因首位,尽管有如他汀类药物、血管紧张素转化酶抑制剂以及B-受体阻滞药等治疗性药物,心血管疾病的发病率一直持续增长,因此需要开发新型的治疗手段。最近,有研究结果表明miR-29b的过表达可以减轻慢性肾脏疾病的纤维化、肺脏纤维化及心脏纤维化。我们之前的研究表明,EA功能化的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGEA)具有大量的仲胺基团,使其具有良好的基因传递效率,同时,由于其侧链上含有大量的羟基,使得材料的毒性较低,并且,特殊形状(如星型或梳状)阳离子聚合物与同等分子量的线性聚合物相比,具有更低的细胞毒性和更高的转染效率,在此基础之上,我们利用BIBB修饰的季戊四醇(PER)作为引发剂,与GMA进行ATRP聚合,合成星状聚合物star-like PGMA (s-PGMA),并通过后续的EA功能化,合成以PER为核心的星型阳离子聚合物基因载体s-PGEA,该载体在小鼠心脏成纤维细胞中具有较高的转染效率,并且,s-PGEA还可以与带有下调相关靶基因功能的miR-29b络合,形成均匀的纳米级复合体,通过静脉注射,使药物有效富集到小鼠的心脏部位,通过基因传递,使得miRNA发挥相应的下调功能,能有效减轻小鼠的心脏纤维化。此外,合成的载体材料与PEI相比,具有良好的生物相容性和抗蛋白吸附性,能延长其在体内的循环时间,进而提高载体在体内的效果。综上所述,通过原子转移自由基聚合的方法在不同的功能性材料上接枝甲基丙烯酸酯类聚合物,对构建新型多功能阳离子基因载体具有重要意
【关键词】：基因治疗 阳离子基因载体 甲基丙烯酸酯 ATRP PDMAEMA 氧化石墨稀 PGMA 普鲁兰多糖
【学位授予单位】：北京化工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R450;O631
【目录】：

• 学位论文数据集4-5
• 摘要5-9
• ABSTRACT9-25
• 符号说明25-26
• 第一章 绪论26-42
• 1.1 基因治疗26-28
• 1.2 基因传递系统28-32
• 1.2.1 用于传递基因的病毒载体29
• 1.2.2 非病毒基因传递系统29-30
• 1.2.3 化学法制备的非病毒基因载体30-32
• 1.2.3.1 通过电荷吸引络合DNA的聚阳离子载体30-32
• 1.2.3.2 DNA封装技术32
• 1.2.3.3 DNA吸收32
• 1.3 原子转移自由基聚合在生物医用材料方面的应用32-40
• 1.3.1 ATRP法制备生物活性表面33-35
• 1.3.2 ATRP法应用于制备阳离子聚合物基因载体35-40
• 1.3.2.1 线型均聚物基因载体36-37
• 1.3.2.2 线型嵌段共聚物基因载体37-38
• 1.3.2.3 梳状共聚物基因载体38-39
• 1.3.2.4 星状聚合物基因载体39-40
• 1.4 课题的目的及意义40-42
• 第二章 可快速进行细胞染色的双功能基因载体42-58
• 2.1 前言42
• 2.2 实验部分42-47
• 2.2.1 实验原料与试剂42-44
• 2.2.2 实验仪器与设备44
• 2.2.3 实验方法44
• 2.2.4 双功能阳离子基因载体PBI-PGEA的制备44-45
• 2.2.5 聚合物的化学及光谱学测试45
• 2.2.6 载体的细胞标记性能测试45-46
• 2.2.7 载体的转染能力测试46-47
• 2.2.7.1 PBI-PGE-pDNA复合体的琼脂糖凝胶电泳测试46
• 2.2.7.2 PBI-PGEA/pDNA复合体的粒径及电位测试46-47
• 2.2.7.3 PBI-PGEA/pDNA复合体的转染能力测试47
• 2.3 结果与讨论47-57
• 2.3.1 双功能阳离子基因载体PBI-PGEA的制备47-49
• 2.3.2 PBI-PGEA的光谱性质49-50
• 2.3.3 PBI-PGEA的细胞标记性能测试50-54
• 2.3.4 PBI-PGEA的转染能力测试54-57
• 2.4 小结57-58
• 第三章 基于普鲁兰多糖构建可生物剪切的肝靶向性基因载体58-80
• 3.1 前言58
• 3.2 实验部分58-64
• 3.2.1 实验原料与试剂59-60
• 3.2.2 实验仪器与设备60
• 3.2.3 实验方法60
• 3.2.4 可生物剪切的肝靶向性阳离子基因载体PuPGEA的制备60-61
• 3.2.4.1 可生物剪切的ATRP引发位点的引入60-61
• 3.2.4.2 通过ATRP法合成普鲁兰基阳离子基因载体61
• 3.2.5 阳离子基因载体PuPGEA的化学表征61-62
• 3.2.6 聚合物/pDNA复合体的生理物理学测试62
• 3.2.6.1 琼脂糖凝胶电泳测试62
• 3.2.6.2 粒径及Zeta电位测试62
• 3.2.6.3 PuPGEA/pDNA颗粒形态测试62
• 3.2.7 载体的转染能力及细胞毒性测试62-63
• 3.2.7.1 细胞毒性测试63
• 3.2.7.2 体外转染效率测试63
• 3.2.8 载体的肝靶向性测试63-64
• 3.2.9 载体的溶血性测试64
• 3.3 结果与讨论64-79
• 3.3.1 可生物剪切的肝靶向性阳离子基因载体PuPGEA的制备及化学表征64-68
• 3.3.1.1 阳离子基因载体PuPGEA的制备及核磁表征64-67
• 3.3.1.2 阳离子基因载体PuPGEA的分子量表征67-68
• 3.3.1.3 阳离子基因载体PuPGEA的生物可剪切性测试68
• 3.3.2 载体与DNA复合体的生理物理学表征68-71
• 3.3.3 载体的细胞毒性及转染能力表征71-75
• 3.3.3.1 载体的细胞毒性测试71-73
• 3.3.3.2 载体的体外基因转染效率73-75
• 3.3.4 载体的肝靶向性测试75-77
• 3.3.5 载体的溶血性测试77-79
• 3.4 小结79-80
• 第四章 基于氧化石墨烯构建可生物剪切的基因/药物载体80-102
• 4.1 前言80
• 4.2 实验部分80-87
• 4.2.1 实验原料与试剂80-82
• 4.2.2 实验仪器与设备82
• 4.2.3 实验方法82
• 4.2.4 氧化石墨烯及可生物剪切的阳离子基因载体SS-GPD的制备82-83
• 4.2.4.1 氧化石墨烯的制备82-83
• 4.2.4.2 可生物剪切的ATRP引发位点的引入83
• 4.2.4.3 可生物剪切的PDMAEMA功能化的氧化石墨烯的合成83
• 4.2.5 氧化石墨烯及阳离子基因载体SS-GPD的表征83-84
• 4.2.5.1 X射线光电子能谱测试83-84
• 4.2.5.2 原子力显微镜测试84
• 4.2.5.3 粒径及Zeta电位测试84
• 4.2.5.4 样品的分散性测试84
• 4.2.5.5 PDMAEMA链的分子量测试84
• 4.2.6 载体与DNA复合体的表征84-85
• 4.2.6.1 琼脂糖凝胶电泳测试85
• 4.2.6.2 粒径及Zeta电位测试85
• 4.2.6.3 颗粒形态测试85
• 4.2.7 载体的细胞毒性及转染能力测试85-86
• 4.2.7.1 细胞毒性测试85-86
• 4.2.7.2 体外转染效率测试86
• 4.2.8 载体的载药能力测试86-87
• 4.3 结果与讨论87-99
• 4.3.1 可生物剪切的阳离子基因载体SS-GPD的制备及表征87-91
• 4.3.2 载体与DNA复合体的表征91-94
• 4.3.3 载体的细胞毒性及转染能力表征94-96
• 4.3.3.1 载体的细胞毒性测试94-95
• 4.3.3.2 体外基因转染效率测试95-96
• 4.3.4 载体的载药能力测试96-99
• 4.4 小结99-102
• 第五章 基于季戊四醇构建高性能阳离子基因载体用于减轻小鼠心脏纤维化102-124
• 5.1 前言102-103
• 5.2 实验部分103-108
• 5.2.1 实验原料与试剂103-104
• 5.2.2 实验仪器与设备104
• 5.2.3 实验方法104
• 5.2.4 阳离子基因载体s-PGEA的制备104-105
• 5.2.5 载体的化学表征105
• 5.2.6 载体与miRNA复合体的生理物理学测试105-106
• 5.2.6.1 粒径及Zeta电位测试106
• 5.2.6.2 原子力显微镜(AFM)测试106
• 5.2.6.3 载体的蛋白吸附实验106
• 5.2.7 载体的转染能力及细胞毒性测试106-107
• 5.2.7.1 细胞毒性测试106
• 5.2.7.2 体外基因传递效率测试106-107
• 5.2.8 载体携带miRNA减轻心脏纤维化的动物活体实验107-108
• 5.2.8.1 验证载体/miRNA复合体在心脏部位聚集107
• 5.2.8.2 载体/miRNA减轻小鼠心脏纤维化实验107-108
• 5.3 结果与讨论108-122
• 5.3.1 阳离子基因载体s-PGEA的制备及化学表征108-109
• 5.3.2 载体的生理物理学测试109-111
• 5.3.2.1 粒度及电位测试109-110
• 5.3.2.2 原子力显微镜(AFM)测试110-111
• 5.3.2.3 蛋白吸附实验111
• 5.3.3 载体的转染能力及细胞毒性测试111-116
• 5.3.3.1 细胞毒性测试111-113
• 5.3.3.2 基因传递能力测试113-116
• 5.3.4 载体携带miRNA减轻心脏纤维化的动物活体实验116-122
• 5.3.4.1 验证载体/miRNA在心脏部位聚集116-119
• 5.3.4.2 验证载体/miRNA减轻小鼠心脏纤维化119-122
• 5.4 小结122-124
• 第六章 结论124-126
• 参考文献126-144
• 致谢144-146
• 研究成果及发表的学术论文146-148
• 作者简介148-150
• 导师简介150-151
• 博士研究生学位论文答辩委员会决议书151-152

  本文关键词：甲基丙烯酸酯类高性能基因载体的构建、制备与表征，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：422982