四氢呋喃（THF）降解菌株Rhodococcus sp.YYL的代谢组、定殖与Bacillus cereus HZX互作

发布时间：2017-06-10 11:17

  本文关键词：四氢呋喃（THF）降解菌株Rhodococcus sp.YYL的代谢组、定殖与Bacillus cereus HZX互作关系研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：四氢呋喃(THF)具有广泛用途,同时也是一种持久性环境污染物。微生物降解是去除四氢呋喃污染的最有效手段之一。本论文围绕四氢呋喃降解菌株Rhodococcus sp. YYL进行研究,评价了THF对菌株YYL基础代谢的影响,开展了海藻糖对菌株YYL降解THF及生物强化定殖的影响研究,阐明了非THF降解菌株Bacillus cereus HZX和菌株YYL在降解THF时的互作关系,所获结果分述如下：(1)利用核磁共振(NMR)代谢组学方法研究菌株YYL响应THF时代谢组变化。结果显示菌株YYL在利用酵母膏作为碳源时,THF胁迫对菌株YYL的代谢物几乎没有影响；THF降解过程中,菌株YYL生理代谢发生动态变化,主要是积累海藻糖、加快三羧酸循环(TCA)中从琥珀酸到苹果酸的转化速率和加速蛋白质与核苷酸合成等生理代谢,为更好地发挥THF降解性能。菌株YYL胞内海藻糖积累量与菌株YYL降解THF速率正相关。2 mM海藻糖添加到菌株YYL降解THF的培养基中后,结果表明在初始pH 7.0时,相对于菌株YYL在较适生长初始pH 8.26,菌体细胞需要外源海藻糖起保护剂的作用,体现在2 mM海藻糖能提高THF单加氧酶基因(thm)的转录表达、琥珀酸脱氢酶(SDH)活力、ATPase酶活力、丙酮酸激酶(PK)活力、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力及谷胱甘肽(GSH)含量。(2)海藻糖作为生物刺激物应用于菌株YYL生物强化过程中,2 mM海藻糖能帮助菌株YYL更好地定殖于THF处理反应器中,使THF降解效率更高,使高浓度THF对反应器微生物菌群的胁迫影响降低,具体表现为：活性污泥菌群丰度提高,多样性更加丰富,菌群活性增强,胞外多聚物(EPS)含量增多,活性污泥沉降性能改善。可溶性单铁单加氧酶(SDIMOs)是一种重要的多组分酶,存在于许多菌株中,主要负责碳氢类化合物初始氧化步骤。细胞色素P450氧化酶(P450s)是一种通用性多功能酶,主要负责非活性碳氢化合物的氧化。通过PCR-DGGE.克隆文库及qPCR技术研究上述两个酶的编码基因多样性及丰度。结果表明THF废水处理反应器中,添加2 mM海藻糖能帮助基因SDIMO、CYP153保存更高的多样性及丰度,推测适量海藻糖可以增强拥有上述两个基因的菌株环境适应性。生物修复时,有机物降解势必会影响系统中的生物脱氮效率。2 mM海藻糖对于氮循环(硝化与反硝化)功能菌的影响呈现差异化：对于氨氧化细菌(AOB),添加2 mM海藻糖利于其维持更高多样性,加快氨氮转化；对于反硝化功能菌,添加2 mM海藻糖利于编码Cu亚基的亚硝酸还原酶基因(nirK)保存更高多样性和丰度,但降低了编码细胞色素cdl亚基的亚硝酸还原酶基因(nirS)和一氧化二氮还原酶基因(nosZ)的多样性和丰度。(3)THF降解菌株YYL与非降解菌株Bacillus cereus HZX的互作关系研究中,互作结果主要取决于菌株YYL所处环境pH,在菌株YYL降解THF最适pH 8.26时,菌株YYL能高效降解THF；不利pH 7.0条件下,菌株YYL与HZX以1：0.5混合时,菌株YYL降解基因thm转录表达活性增强,THF降解效率更高,培养基pH值下降更明显,混合菌中的菌株HZX比例升高。菌株YYL和菌株HZX在按1：0.5比例混合时,使用转录组学方法分析菌株间互作机制。相对于初始pH 8.26,初始pH 7.0培养下菌株YYL更加需要菌株HZX的帮助。初始pH7.0时,菌株HZX通过利用从菌株YYL降解THF过程中代谢产物而存活,作为回报,菌株HZX通过增强某些基因表达帮助菌株YYL行使一些基础代谢功能,例如合成氨基酸、进行糖转化、合成2-氧代羧酸及合成不饱和脂肪酸亚油酸等。互作使菌株YYL发挥更高的THF降解效率。
【关键词】：Rhodococcus sp.YYL 核磁共振 海藻糖 生物强化 生物刺激 SDIMOs P450s 硝化与反硝化细菌 Bacillus cereus HZX 互作关系
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：X172
【目录】：

• 致谢7-8
• 缩写注餐8-12
• 摘要12-14
• Abstract14-17
• 第一章 文献综述17-43
• 1. 四氢呋喃降解菌及降解途径的研究17-23
• 1.1 四氢呋喃降解菌的分离与种类17-18
• 1.2 四氢呋喃降解途径的研究进展18-22
• 1.3 四氢呋喃单加氧酶及其基因研究进展22-23
• 2. 基础代谢组学在微生物研究中的运用23-30
• 2.1 代谢组学研究微生物响应环境压力25-27
• 2.2 代谢组学研究微生物基因功能27-29
• 2.3 代谢组学在发酵工艺的监控和优化中的运用29
• 2.4 代谢组学在环境微生物领域的运用29-30
• 2.5 展望30
• 3. 海藻糖在细胞应对逆境胁迫响应与适应中的作用机制30-34
• 3.1 微生物细胞内海藻糖的积累机制31-32
• 3.2 海藻糖保护微生物细胞的作用机制32-33
• 3.3 展望33-34
• 4. 生物强化中的微生物定殖研究34-36
• 4.1 与生物刺激法联合34-35
• 4.2 利用生物载体将强化微生物固定化35
• 4.3 投加与降解菌产生共聚效应的菌株35-36
• 5. 微生物在生物降解过程中的互作关系研究36-39
• 5.1 互作模式的类型36-39
• 5.2 展望39
• 6. 研究的目的、意义及主要内容39-43
• 6.1 研究的目的和意义39-40
• 6.2 研究的主要内容40-43
• 第二章 四氢呋喃下Rhodococcus sp.YYL的代谢组研究43-73
• 第一节 Rhodococcus sp.YYL代谢网络变化研究44-61
• 1. 材料与方法45-49
• 1.1 材料与试剂45
• 1.2 实验方法45-49
• 2. 结果与分析49-57
• 2.1 红球菌YYL代谢物的谱图49-52
• 2.2 PCA法分析红球菌YYL代谢组整体水平差异52-53
• 2.3 OPLS-DA验证红球菌YYL代谢物的变化53-55
• 2.4 菌株YYL在降解THF时基因表达的变化55-57
• 3. 小结与讨论57-61
• 3.1 与能量代谢相关的糖酵解循环58-59
• 3.2 与THF降解相关的三羧酸循环(TCA)59
• 3.3 与渗透调节相关的代谢59-60
• 3.4 氨基酸及核苷酸代谢60-61
• 第二节 海藻糖对Rhodococcus sp.YYL降解THF性能的影响研究61-73
• 1. 材料与方法62-65
• 1.1 培养基62
• 1.2 样品收集与蛋白、RNA的提取62-63
• 1.3 THF气象色谱测定条件63
• 1.4 蛋白定量、酶活与反映抗氧化活性的物质测定63-64
• 1.5 实时荧光定量PCR分析64-65
• 2. 结果与分析65-70
• 2.1 海藻糖对菌株YYL降解THF的影响65-67
• 2.2 海藻糖对菌株YYL降解THF时能量代谢影响67-68
• 2.3 海藻糖对菌株YYL降解THF时的抗氧化系统影响68-70
• 3. 小结与讨论70-73
• 第三章 海藻糖在处理四氢呋喃废水系统中的生态效应73-110
• 第一节 细菌总群落结构变化研究及胞外多糖成分分析74-84
• 1. 材料与方法75-77
• 1.1 反应器运行75-76
• 1.2 活性污泥总DNA提取76
• 1.3 454焦磷酸测序及数据分析76-77
• 1.4 活性污泥混合液悬浮固体(MLSS)测定77
• 1.5 EPS提取及测定77
• 2. 结果与分析77-83
• 2.1 序列质量评估77-78
• 2.2 Beta多样性分析78-79
• 2.3 物种丰度分析79-80
• 2.4 依据门类分类水平的微生物群落结构分析80-82
• 2.5 污泥中胞外多聚物(EPS)含量变化82-83
• 3. 小结与讨论83-84
• 第二节 可溶性单铁单加氧酶基因(SDIMO)及细胞色素P450氧化酶基因(CYP153)多样性分析84-97
• 1. 材料与方法85-88
• 1.1 反应器运行85
• 1.2 活性污泥总DNA提取85-86
• 1.3 污泥降解THF摇瓶实验86
• 1.4 基因SDIMO和CYP153的PCR扩增86
• 1.5 变性梯度凝胶电泳(DGGE)86-87
• 1.6 基因SDIMO和CYP153克隆文库分析87
• 1.7 荧光定量PCR(qPCR)分析87-88
• 2. 结果与分析88-95
• 2.1 反应器污泥THF降解效率88
• 2.2 基因SDIMO丰度及多样性变化88-92
• 2.3 基因CYP153丰度及多样性变化92-95
• 3. 小结与讨论95-97
• 第三节 参与氮循环细菌菌群结构变化研究97-110
• 1. 材料与方法97-99
• 1.1 反应器运行97
• 1.2 活性污泥总DNA提取97-98
• 1.3 可溶性无机氮的测定98
• 1.4 氮循环相关功能基因的PCR扩增98
• 1.5 变性梯度凝胶电泳(DGGE)98-99
• 1.6 功能基因克隆文库分析99
• 1.7 荧光定量PCR(qPCR)分析99
• 2. 结果与分析99-108
• 2.1 反应器出水中可溶性无机氮含量变化99-100
• 2.2 氮循环相关功能基因DGGE结果100-104
• 2.3 氮循环相关功能基因克隆文库分析104-107
• 2.4 氮循环相关功能基因qPCR分析107-108
• 3. 小结与讨论108-110
• 第四章 THF降解菌Rhodococcus sp.YYL与非降解菌Bacillus cereus HZX的互作关系研究110-138
• 第一节 THF降解菌Rhodococcus sp.YYL与非降解菌Bacillus cereus HZX共培养中的相互影响111-117
• 1. 材料与方法111-113
• 1.1 培养基及菌株接种量111-112
• 1.2 THF浓度及pH值测定112
• 1.3 菌株比例测定112
• 1.4 基因thm的表达水平检测112-113
• 2. 结果与分析113-116
• 2.1 THF降解曲线113
• 2.2 培养基中pH值变化曲线113-114
• 2.3 THF单加氧酶基因表达水平变化(thm/Ru)114-115
• 2.4 菌株YYL与HZX的比例变化(thm/GEM)115-116
• 3. 小结与讨论116-117
• 第二节 单独培养与共培养中的宏转录组学比较分析117-138
• 1. 材料与方法117-122
• 1.1 样品准备117
• 1.2 总RNA提取与质检117-118
• 1.3 转录组测序118-119
• 1.4 数据预处理119-120
• 1.5 序列组装120
• 1.6 NR注释120
• 1.7 基因组成分析120-121
• 1.8 基因定量121
• 1.9 基因功能注释121-122
• 1.10 差异基因表达及其GO、KEGG显著性富集分析122
• 2. 结果与分析122-136
• 2.1 样品总RNA提取122-123
• 2.2 序列组装123-124
• 2.3 基于对公共数据库检索的功能注释124-128
• 2.4 基因表达差异分析128-129
• 2.5 差异基因GO显著性富集分析129-132
• 2.6 差异基因KEGG显著性富集分析132-135
• 2.7 THF降解相关基因表达分析135-136
• 3. 小结与讨论136-138
• 第五章 论文总结138-140
• 1. 论文的主要研究结论138
• 2. 论文的创新之处138-139
• 3. 论文的不足与展望139-140
• 参考文献140-160
• 攻读博士学位期间研究成果与个人荣誉160

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 Donghui Wen;Jing Zhang;Ruilin Xiong;Rui Liu;Lujun Chen;;Bioaugmentation with a pyridine-degrading bacterium in a membrane bioreactor treating pharmaceutical wastewater[J];Journal of Environmental Sciences;2013年11期

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本文编号：438313