家蚕体相关蛋白乙酰化修饰鉴定及其对蚕丝蛋白合成影响的研究

发布时间：2017-08-29 08:26

  本文关键词：家蚕体相关蛋白乙酰化修饰鉴定及其对蚕丝蛋白合成影响的研究

  更多相关文章： 家蚕 乙酰化修饰 调控 蚕丝蛋白合成 丝胶蛋白 营养储藏蛋白 SP蛋白

【摘要】：我们的祖先通过人工驯养和选择将野蚕驯化为家蚕,将家蚕的产丝性能提高了约10倍。上世纪30年代,利用一代杂种优势又将蚕丝产量提高了近20%。至此以后,家蚕的产丝性能达到了顶峰,再也难以逾越,到目前为止还没有革命性的突破。现今,要取得新的突破必须从分子水平寻找家蚕丝蛋白合成的相关因素,并获得丝蛋白调控的理论基础,因此,丝蛋白合成的调控机制研究越来越受到人们的关注。本课题首次从蛋白翻译后修饰角度研究了乙酰化修饰对家蚕丝蛋白合成的调控及其对蚕丝性能的影响,可为家蚕产丝性能的突破和蚕丝品质的改良提供新的理论依据。由于乙酰化修饰可以改变蛋白质功能,因此我们首先使用乙酰化多肽富集与nano-HPLC/MS/MS结合,大规模鉴定了家蚕的乙酰化组,首次从家蚕体中鉴定了342个乙酰化蛋白,包含667个赖氨酸乙酰化修饰(Lysine acetylation,Kac)位点,乙酰化修饰的平均程度为1.9。含有5个以上Kac位点的乙酰化蛋白有20个,含有11个以上Kac位点的高度乙酰化蛋白有7个,大部分为营养储藏蛋白和丝胶蛋白,如储藏蛋白SP、卵黄蛋白(vitellogenin)和家蚕载脂蛋白(apolipophorin)以及丝胶蛋白2(sericin2,Ser2)。Kac位置偏好性分析发现存在5个显著富集的Kac位点基序,分别为KH、KY、KF、K*F和F*K,占整个Kac位点的55.7%,且倾向位于蛋白的无规卷曲结构中。功能分析表明,乙酰化蛋白主要参与家蚕体内的物质与能量代谢,同时调控氨基酸的生物合成和存储。总之,家蚕体内的物质和能量代谢受到乙酰化修饰的严格调控,尤其是蛋白和氨基酸的生物合成和代谢。幼虫阶段是家蚕唯一摄食阶段,本阶段家蚕务必储藏足够的营养以备蚕丝蛋白合成和后续发育的营养需要。上述研究表明,储藏脂肪的载脂蛋白、30K蛋白和卵黄蛋白以及储藏氨基酸的储藏蛋白SP(含SP1、SP3和SP3)等4类营养储藏蛋白存在大量的Kac位点。暗示乙酰化调控可能为家蚕营养储藏、转运和代谢的常规调控。发育期的蛋白表达谱和乙酰化谱进一步证实,SP的蛋白水平和乙酰化水平在家蚕5龄幼虫前中期丰度较高,在后期和吐丝期含量较低。由于SP蛋白主要负责储藏氨基酸,因此5龄幼虫前中期表达的大量SP蛋白及其储藏的氨基酸可能为后期大量丝蛋白的合成提供氨基酸来源。同时研究表明,发育期sp蛋白的乙酰化水平随蛋白水平的变化而变化,进一步实验证实,乙酰化水平下调的家蚕细胞中sp蛋白的含量急剧减少,因此,我们推测乙酰化修饰和sp蛋白储藏氨基酸的水解释放和利用控制有关,乙酰化修饰可通过调控氨基酸的供给间接调控蚕丝蛋白的合成。结合其他营养储藏蛋白在家蚕幼虫发育期的乙酰化谱,我们证实家蚕营养储藏类蛋白的高度乙酰化可能暗示了一种新的调控家蚕营养贮藏和水解利用的新机制,这个机制和丝蛋白的合成相关。进一步的分子机制研究表明,sp蛋白的赖氨酸乙酰化修饰可与泛素化修饰竞争,导致蛋白泛素化水平下调,最终抑制泛素介导的蛋白酶体降解途径,提高sp蛋白稳定性和含量。因此,乙酰化修饰可通过竞争泛素化位点调控营养储藏蛋白的稳定和水解,从而调控其所储藏营养物质的储存与释放利用,最终影响和调控蚕丝蛋白的合成。综上所述,家蚕5龄幼虫前中期sp蛋白的乙酰化修饰可通过竞争泛素化修饰导致蛋白大量积累,储藏大量多余的氨基酸;幼虫后期sp蛋白去乙酰化,导致蛋白剧烈降解并释放其所储藏的大量氨基酸以供丝蛋白的合成。乙酰化修饰参与了蚕丝蛋白的合成调控,是丝蛋白合成调控的新机制。蚕丝表层覆盖有丝胶蛋白,包括ser1、ser2和ser3。我们首次通过质谱鉴定ser2蛋白存在20多个kac位点;发育期乙酰化谱检测进一步发现ser1和ser3同样存在高度乙酰化修饰。根据淀粉乙酰化后的类固态形态的变化,我们推测丝胶蛋白的高度乙酰化有助于增强丝胶蛋白在蚕丝丝素纤维表层的附着力,这可能和丝胶蛋白乙酰基上的羰基氧原子与丝素纤维表层大量分布的酪氨酸、赖氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸和丝氨酸等氨基酸侧链的亲水基团形成氢键等弱相互作用有关。根据甲壳素在碱水热处理下可去乙酰化并从不溶到可溶的性质转变,我们推测皂碱法热处理的蚕丝精练脱胶过程实际上是一个丝胶蛋白去乙酰化增加溶解度或破坏丝胶蛋白与丝素表层氢键的过程,这为蚕丝精练脱胶工艺的改进提供了新的理论依据。最后我们研究了乙酰化对家蚕细胞和蚕丝合成的影响。首先采用去乙酰化酶抑制剂tsa和乙酰化酶抑制剂c646分别上调和下调细胞乙酰化水平,证实乙酰化水平的上升可以增强细胞的抗凋亡能力。进一步采用注射tsa或c646的方法处理家蚕5龄幼虫,收集制备乙酰化修饰蚕丝,力学测试表明,乙酰化水平下降可导致蚕丝断裂强度和断裂伸长率都有一定的下降,而乙酰化水平上升导致蚕丝的断裂伸长率有一定的上升,但总体来说,乙酰化对蚕丝的力学性能影响较小;红外光谱分析显示乙酰化对蚕丝纤维的结构影响也不大;XRD表征分析表明,乙酰化修饰蚕丝和对照蚕丝相比其结晶区较为稳定,结晶结构基本没有发生变化,说明丝胶蛋白的乙酰化仅仅只能改变丝胶的性质,不会对蚕丝丝素纤维的结晶区结构产生影响;扫描电子显微镜(SEM)观察显示,同样脱胶条件下,乙酰化修饰组蚕丝的丝素表层附着一定的丝胶残留,而乙酰化下降和对照组蚕丝的丝素表层较为干净,进一步证实了丝胶蛋白的乙酰化具有增强丝胶与丝素表层附着力的作用。综上所述,本课题首次发现乙酰化修饰可以通过调控氨基酸的供应影响蚕丝蛋白的合成;首次发现丝胶蛋白存在高度的乙酰化修饰,证实乙酰化修饰可以增强丝胶蛋白在丝素纤维表层的附着力。上述发现是蚕丝蛋白合成调控的新机制,可为家蚕产丝性能的提高以及蚕丝精练脱胶和染整工艺的改进提供新的理论依据。
【关键词】：家蚕 乙酰化修饰 调控 蚕丝蛋白合成 丝胶蛋白 营养储藏蛋白 SP蛋白
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS141
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-14
• 第一章 前言14-29
• 1.1 课题背景与意义14-15
• 1.2 蛋白质的乙酰化修饰及其功能15-21
• 1.2.1 蛋白质的乙酰化修饰15-16
• 1.2.2 组蛋白乙酰化酶与去乙酰化酶16-18
• 1.2.3 非组蛋白的乙酰化修饰18-21
• 1.2.3.1 非组蛋白乙酰化与蛋白结构的关系18-19
• 1.2.3.2 非组蛋白的乙酰化通过与泛素化修饰竞争提高蛋白稳定性19-21
• 1.3 家蚕蚕丝蛋白21-25
• 1.3.1 丝素蛋白组成及结构21-22
• 1.3.2 丝胶蛋白结构及特性22-25
• 1.3.2.1 家蚕丝胶蛋白22
• 1.3.2.2 非家蚕蚕丝丝胶蛋白22-23
• 1.3.2.3 家蚕丝胶基因的结构与表达特性23-24
• 1.3.2.4 丝胶蛋白的物理特性24-25
• 1.4 家蚕营养储藏蛋白及其功能25-26
• 1.5 论文研究目的和主要研究内容26-29
• 1.5.1 研究目的26
• 1.5.2 主要研究内容26-28
• 1.5.3 课题创新点28-29
• 第二章 家蚕蛋白乙酰化修饰的高通量鉴定29-52
• 2.1 材料、试剂及仪器设备29-32
• 2.1.1 主要材料与仪器29
• 2.1.2 主要试剂29
• 2.1.3 主要试剂配制29-32
• 2.2 方法32-34
• 2.2.1 家蚕总蛋白的提取和乙酰化的Western blot检测32
• 2.2.2 乙酰化肽段富集和高精度质谱nano-HPLC-MS/MS分析32-33
• 2.2.3 乙酰化蛋白的注释和生物信息学功能分析33-34
• 2.2.3.1 蛋白注释33-34
• 2.2.3.2 功能富集分析34
• 2.2.3.3 二级结构分析34
• 2.2.3.4 乙酰化位点序列模式分析34
• 2.3 结果与讨论34-50
• 2.3.1 家蚕总蛋白乙酰化Western blot检测34-36
• 2.3.2 高精度质谱高通量鉴定家蚕蛋白乙酰化修饰36-37
• 2.3.3 家蚕蛋白乙酰化位点具有特定的模式和偏好性37-39
• 2.3.4 家蚕乙酰化蛋白的功能特征39-43
• 2.3.5 乙酰化修饰可能为家蚕营养储藏、转运和代谢调控的常见机制43-48
• 2.3.6 乙酰化修饰可能参与家蚕幼虫期蚕丝的合成调控48-50
• 2.4 本章结论50-52
• 第三章 家蚕各发育期营养储藏蛋白和丝蛋白乙酰化的鉴定及其功能分析52-65
• 3.1 材料、试剂及仪器设备52-55
• 3.1.1 主要材料与仪器52
• 3.1.2 主要试剂52
• 3.1.3 主要试剂配制52-55
• 3.2 方法55-57
• 3.2.1 家蚕的饲养55
• 3.2.2 家蚕各发育期营养储藏蛋白乙酰化的鉴定55
• 3.2.3 家蚕各发育期丝蛋白乙酰化的鉴定55
• 3.2.4 SDS-PAGE鉴定55-56
• 3.2.5 Western blot鉴定56
• 3.2.6 PAGE胶点蛋白HPLC-MS/MS鉴定56-57
• 3.3 结果与讨论57-63
• 3.3.1 家蚕各发育期营养储藏蛋白乙酰化的情况57-59
• 3.3.2 家蚕各发育期蚕丝蛋白乙酰化的情况59-60
• 3.3.3 丝胶蛋白乙酰化的功能预测与分析60-63
• 3.4 本章结论63-65
• 第四章 乙酰化修饰提高SP2蛋白水平的机制研究及其调控蚕丝蛋白合成的过程分析65-75
• 4.1 材料、试剂及仪器设备65-66
• 4.1.1 主要材料与仪器65
• 4.1.2 主要试剂65
• 4.1.3 主要试剂配制65-66
• 4.2 方法66-68
• 4.2.1 家蚕BmN细胞贴壁培养66
• 4.2.2 TSA及C646对SP2蛋白含量的影响66-67
• 4.2.3 CHX抑制蛋白质合成对TSA上调SP2含量的影响67
• 4.2.4 MG132抑制蛋白质的泛素化降解途径对TSA上调SP2含量的影响67
• 4.2.5 家蚕细胞中重组HIS-SP2蛋白的免疫共沉淀67-68
• 4.2.6 SP2蛋白赖氨酸乙酰化及泛素化修饰的竞争鉴定68
• 4.3 结果与讨论68-73
• 4.3.1 乙酰化修饰对SP2蛋白表达含量的影响68-70
• 4.3.2 乙酰化修饰通过抑制蛋白酶体降解途径来提高SP2蛋白含量70-71
• 4.3.3 乙酰化修饰通过竞争SP2蛋白的泛素化修饰来抑制泛素介导的蛋白酶体降解途径71-72
• 4.3.4 乙酰化修饰调控蚕丝蛋白合成的过程分析72-73
• 4.4 本章结论73-75
• 第五章 乙酰化修饰对家蚕细胞和蚕丝合成的影响研究75-88
• 5.1 材料、试剂及仪器设备75-77
• 5.1.1 主要材料与仪器75
• 5.1.2 主要试剂75-76
• 5.1.3 主要试剂配制76-77
• 5.2 方法77-80
• 5.2.1 SP2蛋白真核表达载体pIEx1BmSP2的构建77-79
• 5.2.1.1 SP2基因的PCR扩增77-78
• 5.2.1.2 PCR产物的酶切78
• 5.2.1.3 连接反应78-79
• 5.2.1.4 连接产物的转化79
• 5.2.1.5 重组质粒的筛选与鉴定79
• 5.2.1.6 重组质粒的测序鉴定79
• 5.2.2 乙酰化对家蚕细胞生长的影响79-80
• 5.2.3 乙酰化蚕丝样品的制备80
• 5.2.4 乙酰化蚕丝的性能测试80
• 5.3 结果与讨论80-87
• 5.3.1 SP2真核表达载体的构建80-81
• 5.3.2 乙酰化对家蚕BmN细胞抗凋亡的作用81-82
• 5.3.3 乙酰化蚕丝的力学性能82-84
• 5.3.4 乙酰化蚕丝的红外光谱检测84-85
• 5.3.5 乙酰化蚕丝的X射线衍射检测85
• 5.3.6 乙酰化蚕丝的扫描电镜表征85-87
• 5.4 本章结论87-88
• 第六章 结论与展望88-91
• 6.1 结论88-89
• 6.2 展望89-91
• 参考文献91-99
• 致谢99-100
• 博士在读期间发表论文100-101
• 附录101-128

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本文编号：752294