基于微流控芯片的蛋白质高灵敏快速检测技术研究

发布时间：2017-09-15 17:28

  本文关键词：基于微流控芯片的蛋白质高灵敏快速检测技术研究

  更多相关文章： 微流控芯片 温度敏感聚合物 硼酸亲和 胶体金免疫层析试纸条 富集 快速检测

【摘要】：如何从种类繁多、成分复杂且含量较低的生物样品中实现目标蛋白的高灵敏快速检测,一直以来都是分析工作者所追求并致力解决的科学问题之一。目前发展的多种大型检测设备可以用于蛋白质的高效、准确、灵敏的检测,但尚不能满足目前环境监测、食品安全、医疗卫生、毒品检测等领域所追求的实时、快速检测的需求。微流控芯片已经发展成为一种极具潜力的分析平台,它可以与实验室中的生物技术与分析方法,如样品的取样、前处理、反应、富集分离、检测等进行集成,最终形成一种具有操作简单、便于携带、实时、高通量检测特点的快速现场检测方法。本论文以微流控芯片技术为手段,重点研究:(1)通道内壁修饰方法。通过减少蛋白质的非特异性吸附,提高蛋白质的检测灵敏度。(2)发展了两种新型温度敏感硼酸亲和特性的微流控芯片。通过简单的调节温度,实现样品蛋白的快速捕获与释放,进而提高检测的灵敏度。(3)基于胶体金免疫色谱技术,发展了一种新型的胶体金免疫色谱微流控芯片,实现了蛋白质的快速、连续、可视化、便携检测。主要研究内容包括以下几个方面:1.发展了一种通道内壁简单的涂层技术,抑制蛋白质的非特异性吸附。为了实现微流控芯片对蛋白质样品的高灵敏检测,制备了一种新型、简单的微流控芯片涂层方法—牛血清白蛋白(BSA)涂层,以降低目标蛋白的非特异性吸附,提高检测灵敏度。由于毛细管和玻璃芯片的材质是相同的,并且可以直接以碱性蛋白为研究对象,所以采用毛细管电泳仪(UV检测器)来表征其涂层效果。经过优化,其最佳的涂层条件为:磷酸盐缓冲液的pH值为4.2,涂层静置时间为12 h,涂层BSA浓度为1.5 mg/mL。利用这种涂层的毛细管,实现了核糖核酸酶、溶菌酶、胰蛋白酶和肌红蛋白四中碱性蛋白混合物的分离。最后,将这种涂层方法应用到微流控芯片中。这种涂层方法的涂层过程简单、快速,并且涂层具有良好的稳定性和重现性。2.制备了一种基于P(NIPAAm-co-AAPBA)的温度敏感亲和PDMS微流控芯片,实现了对目标样品的选择性富集分离。通过UV诱导的接枝聚合反应,在PDMS微流控芯片中接枝了P(NIPAAm-co-AAPBA),通过调节温度而不改变流动相的p H值,来捕获和释放样品中含有顺式二羟基的生物分子,如腺苷、糖蛋白、酶等。通过调节温度从4℃到55℃,P(NIPAAm-co-AAPBA)接枝的PDMS微芯片成功用于含有顺式二羟基的腺苷分子的捕获与释放。经过进一步的发展,构建的PDMS微流控芯片可以作为一种潜在的工具,用于顺式二羟基生物分子如:辣根过氧化物酶和糖蛋白等样品的捕获与释放。3.制备了一种基于P(NIPAAmco-VPBA)的温度敏感亲和玻璃微流控芯片,实现对目标蛋白质的选择性富集分离。通过表面引发原子转移自由基聚合反应(SI-ATRP),在玻璃微流控芯片的表面成功接枝了P(NIPAAmco-VPBA),制备了一种具有温度响应硼酸亲和效应的微流控芯片。通过简单的温度调节(从4℃到55℃),接枝有P(NIPAAmco-VPBA)聚合物的微流控芯片,可以专一性、选择性的从腺苷和脱氧腺苷混合物中,快速实现顺式二羟基生物分子腺苷的捕获与释放,从进样到样品的收集总共需要不到10 min。这种P(NIPAAmco-VPBA)聚合物接枝的微流控芯片会成为一种潜在的工具,用于高选择性和重现性的对含有顺式二羟基的生物分子如糖蛋白、糖类、糖基化肽段、核酸等的富集。4.制备了一种胶体金免疫色谱试纸条和胶体金免疫色谱微流控芯片,实现了IL-6和TNF-α的连续、快速、可视化检测。酶联免疫吸附实验(ELISA)是检测白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)最常用的方法。然而,这种方法耗时,并且需要消耗大量的样品。与ELISA相比较,胶体金免疫色谱试纸条,由于具有检测速度快,灵敏度高,专一性强,处理方法简单,适用于多种样品的检测,需要的样品量少,可以长时间存放,价格便宜和不需要高端技术的仪器等优点。因此本论文制备了一种胶体金免疫色谱试纸条和胶体金免疫色谱微芯片用于连续、快速、可视化检测IL-6和TNF-α,其最低检测限分别为62.5 ng/mL和30 ng/mL。在不使用任何仪器的条件下,利用这种胶体金免疫色谱试纸条和微芯片可以简单、高效、快速实现目标蛋白质的检测。
【关键词】：微流控芯片 温度敏感聚合物 硼酸亲和 胶体金免疫层析试纸条 富集 快速检测
【学位授予单位】：北京理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ937
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 第1章 绪论14-36
• 1.1 微流控芯片14-16
• 1.1.1 微流控芯片技术14
• 1.1.2 微流控芯片内壁修饰14-16
• 1.2 微流控芯片富集技术16-23
• 1.2.1 基于吸附的固相萃取富集技术16-17
• 1.2.2 基于多孔滤膜的富集技术17-18
• 1.2.3 基于电驱动的富集技术18-19
• 1.2.4 基于温度敏感硼酸亲和材料的富集技术19-23
• 1.3 微流控芯片分析检测技术23-25
• 1.3.1 微流控芯片电化学检测23-24
• 1.3.2 微流控芯片荧光检测24
• 1.3.3 微流控芯片化学发光检测24-25
• 1.4 胶体金免疫层析试纸条25-33
• 1.4.1 胶体金纳米颗粒及其性能25-26
• 1.4.2 胶体金免疫试纸条的结构及其检测原理26-28
• 1.4.3 胶体金免疫试纸条的应用28-33
• 1.5 本论文的主要研究内容及选题意义33-36
• 第2章 基于涂层改性的蛋白质微流控芯片检测方法研究36-49
• 2.1 试剂耗材37-39
• 2.1.1 实验试剂37
• 2.1.2 实验仪器与耗材37-38
• 2.1.3 试剂配制38-39
• 2.2 实验方法39-40
• 2.2.1 毛细管涂层过程39
• 2.2.2 毛细管电泳系统39-40
• 2.3 结果与讨论40-48
• 2.3.1 最佳的涂层缓冲液pH和涂层BSA浓度的优化40-43
• 2.3.2 BSA涂层静置时间长短的优化43-44
• 2.3.3 毛细管内壁涂层的稳定性考察44-45
• 2.3.4 涂层毛细管的重现性45
• 2.3.5 涂层毛细管对蛋白质的分离45-47
• 2.3.6 BSA涂层在微流控芯片中的应用47-48
• 2.4 小结48-49
• 第3章 基于P(NIPAAM-CO-AAPBA)的PDMS微流控芯片蛋白质富集技术49-66
• 3.1 试剂耗材49-51
• 3.1.1 实验试剂49-50
• 3.1.2 实验仪器与耗材50-51
• 3.1.3 试剂的配制51
• 3.2 实验方法51-56
• 3.2.1 3-丙烯酰胺基苯硼酸（AAPBA）的合成51-52
• 3.2.2 P(NIPAAm-co-AAPBA)接枝的PDMS基片的制备52-53
• 3.2.3 P(NIPAAm-co-AAPBA)接枝的PDMS微流控芯片的制备53-56
• 3.3 结果与讨论56-64
• 3.3.1 PDMS基片在二苯甲酮中的最佳浸泡时间的优化56-57
• 3.3.2 接枝聚合反应中UV照射时间长短的优化57-58
• 3.3.3 氯仿浸泡对PDMS基片表面接枝聚合的影响58-59
• 3.3.4 P(NIPAAm-co-AAPBA)接枝的PDMS基片表面的电镜表征59-60
• 3.3.5 P(NIPAAm-co-AAPBA)接枝的PDMS基片表面水接触角的测量60-61
• 3.3.6 P(NIPAAm-co-AAPBA)接枝的PDMS基片表面FTIR表征61-62
• 3.3.7 P(NIPAAm-co-AAPBA)接枝的PDMS微流控芯片用于捕获与释放腺苷分子62-64
• 3.4 小结64-66
• 第4章 基于P(NIPAAM-CO-VPBA)的玻璃微流控芯片蛋白质富集技术66-78
• 4.1 试剂耗材66-69
• 4.1.1 实验试剂66-67
• 4.1.2 实验仪器与耗材67-68
• 4.1.3 试剂的配制68-69
• 4.2 实验方法69-72
• 4.2.1 玻璃基片的预处理69
• 4.2.2 APTES修饰的玻璃基片的制备69
• 4.2.3 2-溴异丁酰溴功能化的玻璃基片的制备69
• 4.2.4 玻璃基片表面原位原子转移自由基聚合（SI-ATRP）反应69-70
• 4.2.5 温度敏感硼酸亲和微芯片的制备及其在腺苷的捕获与释放上的应用70-72
• 4.3 结果与讨论72-77
• 4.3.1 FTIR表征72-73
• 4.3.2 X射线光电子能谱（XPS）元素分析73-76
• 4.3.3 热响应型硼酸亲和玻璃芯片对腺苷的捕获和释放76-77
• 4.4 小结77-78
• 第5章 基于胶体金免疫色谱试纸条及微芯片的蛋白质的快速、连续、可视化检测78-106
• 5.1 试剂耗材82-84
• 5.1.1 实验试剂82
• 5.1.2 实验仪器与耗材82-83
• 5.1.3 试剂的配制83-84
• 5.2 实验方法84-91
• 5.2.1 胶体金的制备84-85
• 5.2.2 胶体金的表征85
• 5.2.3 胶体金-抗体复合物的制备85-87
• 5.2.4 胶体金试纸条的制备及组装87-90
• 5.2.5 胶体金免疫色谱微芯片的制备90-91
• 5.3 结果与讨论91-104
• 5.3.1 胶体金的制备及电镜表征91-92
• 5.3.2 胶体金的紫外表征92-93
• 5.3.3 胶体金制备的重现性考察93-94
• 5.3.4 胶体金-单克隆抗体复合物的制备94-96
• 5.3.5 胶体金溶液与单克隆抗体结合的表征96-97
• 5.3.6 胶体金-抗体复合物重悬缓冲液的优化97-98
• 5.3.7 胶体金免疫色谱试纸条用于检测人IL-698
• 5.3.8 胶体金免疫色谱试纸条用于检测人TNF-α98-100
• 5.3.9 胶体金免疫色谱试纸条用于连续检测IL-6 和TNF-α100-101
• 5.3.10 胶体金免疫色谱微芯片用于细胞炎症因子的检测101-104
• 5.4 小结104-106
• 结论106-108
• 参考文献108-122
• 附录122-126
• 攻读学位期间发表论文与研究成果清单126-128
• 致谢128

【共引文献】

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1 王桐;陈涛;左铁钏;;干细胞培养微流控芯片气室的分析与设计[J];北京工业大学学报;2013年10期

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1 王桐;干细胞微流控芯片的设计、制备、检测与应用研究[D];北京工业大学;2013年

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1 马艳芳;钯纳米颗粒修饰微型电极在毛细管电泳中的应用[D];山东师范大学;2013年

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4 王尧;微流控细胞芯片实现肿瘤细胞捕获及药物筛选的实验研究[D];重庆大学;2013年

5 杜少博;一种应用于生物细胞检测的微流体阵列设计与仿真[D];太原理工大学;2013年

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7 王军;化学修饰微型电极—毛细管电泳法测定生物活性物质[D];山东师范大学;2014年

8 莫满芳;微流控芯片毛细管电泳在细胞分析中的应用研究[D];广东药学院;2013年

9 赵峰;用于细胞筛选的微流控芯片的开发研究[D];河北工业大学;2014年

10 唐晓亮;用于细胞培养的微流体设计及在生物传感检测中的应用[D];太原理工大学;2015年

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