栅藻（Scenedesmus obliquus）的藻菌共生体系的构建及调控

发布时间：2017-10-14 11:07

  本文关键词：栅藻（Scenedesmus obliquus）的藻菌共生体系的构建及调控

  更多相关文章： 产油微藻 藻菌共生体系 胞外多聚物 微生物群落 开放培养

【摘要】：由于光合效率高、生长速度快、含油量高等特性,微藻被认为是最有希望替代化石能源的生物质能源。开放池培养是实现微藻规模化培养的主要方式,但如何提高产油微藻在开放体系中培养的稳定性,增强抵御外界物种侵扰的能力以及进一步提高微藻生物量产率成为限制微藻生物柴油产业化的瓶颈。微藻与微生物的共生体系可以为微藻的生长提供良好的微环境,但目前有关微藻-微生物共生体系中微藻生长和油脂积累特性的研究仍然比较缺乏。木论文以一株产油微藻斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)为研究对象,通过人工构建藻菌共生体系,研究了该体系在自养条件下对栅藻的生长和油脂积累特性的影响及机制,并进一步探索了藻菌共生体系在开放条件下的稳定性和抵御外界物种侵扰的能力。构建了栅藻与真核生物的共生体系(即共培养体系)。当假丝酵母Candida tropicalis和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae分别与纯化后的斜生栅藻共培养时,只有前者可以增加栅藻的生物量、光合活性和油脂含量,它们分别比纯栅藻体系提高了30.3%、61%和22.5%。相反,酿酒酵母则无显著效应。不同初始接种比例的研究结果表明,栅藻和C. tropicalis的接种比例为3：1时,C. tropicalis对栅藻生长的促进效应最显著。C. tropicalis的存在可以消耗上清液中的胞外多聚物(EPS)和溶解氧,从而减轻它们对微藻生长的抑制作用。此外,栅藻和C. tropicalis的共培养仅在无杂菌的封闭式光反应器中可以促进微藻生长并提高其油脂积累能力,在开放条件下,该促进效应并不显著。构建了栅藻与原核生物的共培养体系。对未纯化的栅藻在正常培养过程中细菌菌群的分析表明,有益菌群和有害菌群共同存在于培养体系中。从栅藻培养液中共筛选到5株与栅藻共生的有益菌菌株,它们分别属于不同的种属,包括Brevundimonas aurantiaca(菌株2-1),Rhizobium sp(菌株2-2),Pseudomonas sp(菌株3-4), Acidovorax facilis(菌株3-10)和Diaphorobacter sp.(菌株3-11)。将5株菌株分别与栅藻共培养10天后发现,它们均可以显著提高栅藻的生物量。其中菌株3-10的效果最好,使栅藻生物量增加了24.8%。同时,细菌的存在提高了栅藻油脂的含量,增加了饱和脂肪酸和十八烯酸的比例,降低了不饱和脂肪酸的比例。扫描电镜的结果表明在藻菌共培养体系中,细菌附着在栅藻的表而,这更有利于二者的物质交换。对已构建的微藻-细菌共培养体系进行调控,研究初始接种比例、外源金属离子浓度、缺氮条件以及细菌菌株组合对栅藻生物量、油脂含量和EPS含量的影响。当初始藻菌比例为3：1时,细菌对栅藻生长的促进效果最显著。EPS是藻菌体系调控的核心,外源添加CaCl2的浓度为100 mg/L时,显著提高了藻菌体系EPS中蛋白质和多糖的含量,并且CaCl2的添加并不影响栅藻的生长和油脂含量。在缺氮诱导的条件下,藻菌体系中栅藻的油脂含量和产率最高比纯栅藻体系分别提高了33.3%和73.9%。不同菌株的组合结果表明,菌株2-2,3-4,3-10和3-11的组合效果最显著,可以使栅藻的生物量和油脂含量分别增加28.5%和14.6%。利用Applikon微型反应器研究了栅藻与细菌之间的气体和物质交换,揭示藻菌体系的共生机制。证实细菌的参与可以降低培养系统中的溶解氧,促进栅藻生长,后者又进一步消耗二氧化碳,释放氧气,利于细菌生长,从而形成栅藻与细菌之间气体交换的循环。证实细菌可以降低EPS(包括结合型和游离型)中大分子量化合物以及总有机碳的含量,增加体系中总无机碳的含量,为栅藻的光合作用提供原料。共生体系中栅藻胞外微环境的改变也促使栅藻将胞内的总糖转化为油脂,这些最终促使了栅藻油脂含量的提高。最后,考察了开放条件下藻菌共生体系中栅藻的生物量和油脂积累情况以及该体系的稳定性。经过16天的培养,开放条件下藻菌体系中栅藻的生物量比封闭条件的纯栅藻体系提高了17.1%,比开放条件的纯栅藻体系提高了95%,同时,藻菌体系中栅藻的油脂含量比纯栅藻封闭体系也增加了24%。微生物群落的分析结果证实,藻菌体系中的细菌菌群保持稳定,初始接种的菌种在培养过程中(12天)始终是优势菌群。相反,纯栅藻体系在开放条件下其细菌菌群发生了明显改变,小丰度菌种的比例在培养后期增加到40%。仅在纯栅藻的开放培养体系中检测到有害微型动物,Colpodea(肾形虫属)和Platyophrya(匙口虫属)。可见,藻菌共生体系可以增强微藻培养体系在开放条件下的稳定性,减少有害物种的入侵。
【关键词】：产油微藻 藻菌共生体系 胞外多聚物 微生物群落 开放培养
【学位授予单位】：中国科学院研究生院(过程工程研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q949.2;TE667
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-16
• 前言16-18
• 1 文献综述18-36
• 1.1 微藻概述18-20
• 1.1.1 微藻的定义18
• 1.1.2 微藻的应用18-20
• 1.2 微藻的培养20-24
• 1.2.1 微藻培养的环境因素20-22
• 1.2.2 微藻培养系统22-24
• 1.2.2.1 封闭式光生物反应器22-23
• 1.2.2.2 开放式光生物反应器23-24
• 1.3 藻菌共生体系24-33
• 1.3.1 共生的概念及主要形式25-26
• 1.3.2 藻菌共生体系26-33
• 1.3.2.1 藻菌共生体系促进微藻的生长和培养体系的稳定26-28
• 1.3.2.2 藻菌共生体系对难降解物质和金属离子的去除28-29
• 1.3.2.3 微藻培养过程中微生物种群的变化29-30
• 1.3.2.4 人工混合菌群30-33
• 1.4 本论文的研究思路33-36
• 2 栅藻和酵母菌共培养对栅藻生长和油脂积累的影响36-54
• 2.1 引言36
• 2.2 材料和方法36-41
• 2.2.1 主要实验仪器36-37
• 2.2.2 藻种和培养基37
• 2.2.3 分析方法37-41
• 2.2.3.1 无菌栅藻(纯栅藻)的分离和纯化37
• 2.2.3.2 微藻生物量的测定37-38
• 2.2.3.3 微藻细胞叶绿索a含量的测量38
• 2.2.3.4 微藻光和活性的检测38
• 2.2.3.5 微藻比生长速率38
• 2.2.3.6 微藻二氧化碳固定速率38-39
• 2.2.3.7 胞外多聚物含量的检测39
• 2.2.3.8 微藻油脂含量和油脂脂肪酸组成的检测39
• 2.2.3.9 数据统计分析39-40
• 2.2.3.10 实验设计40-41
• 2.3 结果和讨论41-52
• 2.3.1 酵母菌对栅藻生长的影响41-43
• 2.3.2 酵母菌对栅藻光合活性的影响43-45
• 2.3.3 栅藻和酵母菌初始接种比例对栅藻生长的影响45-49
• 2.3.4 栅藻和C.tropicalis共培养过程中胞外多聚物含量的变化49-50
• 2.3.5 栅藻和C.tropicalis共培养体系中栅藻油脂含量和脂肪酸组成50-51
• 2.3.6 开放条件下栅藻和C.tropicalis共培养体系中栅藻的生长51-52
• 2.4 小结52-54
• 3 栅藻藻菌共生体系的构建及其生长和油脂积累特性54-82
• 3.1 引言54
• 3.2 材料和方法54-59
• 3.2.1 主要实验仪器54
• 3.2.2 实验设计54-55
• 3.2.3 藻种、菌种和培养基55
• 3.2.4 分析方法55-59
• 3.2.4.1 栅藻培养过程中微生物群落的变化55-56
• 3.2.4.2 栅藻培养液中可培养细菌的筛选和鉴定56
• 3.2.4.3 无菌栅藻(纯栅藻)的分离和纯化56
• 3.2.4.4 筛选能够利用栅藻分泌物的微生物56-57
• 3.2.4.5 构建纯栅藻与细菌的共培养体系57
• 3.2.4.6 细菌生物量的测定57
• 3.2.4.7 栅藻生物量的测定57
• 3.2.4.8 环境扫描电镜观察栅藻及其共生菌57-58
• 3.2.4.9 微藻比生长速率58
• 3.2.4.10 胞外多聚物含量的检测58
• 3.2.4.11 胞外多聚物中氨基酸和单糖组成的检测58-59
• 3.2.4.12 栅藻油脂含量和脂肪酸组成的检测59
• 3.2.4.13 数据统计分析59
• 3.3 结果和讨论59-79
• 3.3.1 栅藻培养过程中微生物群落的变化59-64
• 3.3.2 无菌栅藻(纯栅藻)的分离和纯化64-65
• 3.3.3 纯栅藻和未纯化栅藻的生长特性65-66
• 3.3.4 未纯化栅藻中可培养微生物的筛选、纯化与鉴定66-68
• 3.3.5 可利用栅藻胞外多聚物的微生物的筛选68-69
• 3.3.6 人工构建藻菌共生体系中栅藻的生长特性69-73
• 3.3.7 藻菌共生体系中胞外多聚物的含量和组成73-78
• 3.3.8 藻菌体系中栅藻的油脂含量以及脂肪酸组成78-79
• 3.4 小结79-82
• 4 栅藻藻菌共生体系的调控82-104
• 4.1 引言82-83
• 4.2 材料和方法83-86
• 4.2.1 藻种、菌种和培养基83
• 4.2.2 分析方法83-84
• 4.2.2.1 定量PCR检测微藻和细菌的生物量83
• 4.2.2.2 栅藻生物量测定83
• 4.2.2.3 胞外多聚物含量检测83
• 4.2.2.4 栅藻油脂含量和脂肪酸组成83-84
• 4.2.2.5 样品中金属元素的检测84
• 4.2.3 实验设计84-86
• 4.2.3.1 不同初始比例的栅藻/细菌对栅藻生长和油脂积累的影响84
• 4.2.3.2 基于胞外多聚物调控藻菌共生体系84-85
• 4.2.3.3 缺氮调节藻菌体系中微藻的油脂积累85
• 4.2.3.4 多菌种组合对栅藻生长和油脂积累的影响85-86
• 4.2.3.5 数据统计分析86
• 4.3 实验结果和讨论86-101
• 4.3.1 不同初始接种比例对栅藻生长和油脂积累的影响86-88
• 4.3.2 基于胞外多聚物通过添加金属离子调控藻菌体系88-93
• 4.3.3 缺氮调节藻菌体系中微藻的油脂积累93-98
• 4.3.4 多菌种组合对栅藻生长和油脂积累的影响98-101
• 4.4 小结101-104
• 5 藻菌共生体系的共生机制研究104-120
• 5.1 前言104
• 5.2 材料和方法104-106
• 5.2.1 Applikon微型反应器104-105
• 5.2.2 实验设计105
• 5.2.3 分析方法105-106
• 5.2.3.1 胞外多聚物分子量的测定105
• 5.2.3.2 胞外多聚物中总有机碳(TOC)和总无机碳(TIC)的测定105-106
• 5.2.3.3 胞外多聚物含量的检测106
• 5.2.3.4 胞外多聚物中氨基酸和单糖组成的检测106
• 5.2.3.5 通过定量PCR检测微藻和细菌的生物量106
• 5.2.3.6 栅藻油脂含量和脂肪酸组成106
• 5.2.3.7 栅藻胞内蛋白含量的测定106
• 5.2.3.8 栅藻胞内总糖含量的测定106
• 5.3 结果和讨论106-117
• 5.3.1 藻菌共生体系中O_2和CO_2的变化106-111
• 5.3.2 藻菌共生体系中胞外多聚物的变化111-113
• 5.3.3 藻菌共生体系中栅藻胞内化合物含量的变化113-116
• 5.3.4 藻菌共生体系的共生机制116-117
• 5.4 小结117-120
• 6 人工构建藻菌体系在开放条件下的培养效果120-134
• 6.1 引言120
• 6.2 材料和方法120-122
• 6.2.1 实验设计120-121
• 6.2.2 光生物反应器121
• 6.2.3 分析方法121-122
• 6.2.3.1 栅藻生物量的检测121
• 6.2.3.2 胞外多聚物含量的检测121
• 6.2.3.3 栅藻油脂含量的检测121-122
• 6.2.3.4 微生物群落的检测122
• 6.2.3.5 微藻叶绿素含量的检测122
• 6.2.3.6 微藻光和活性的检测122
• 6.3 结果与讨论122-131
• 6.3.1 开放条件下藻菌共生体系中栅藻的生长和油脂含量122-125
• 6.3.2 开放条件下藻菌共生体系中微生物群落的变化125-129
• 6.3.3 开放条件下藻菌共生体系中胞外多聚物含量的变化129-131
• 6.4 小结131-134
• 7 结论与展望134-138
• 7.1 结论134-136
• 7.2 展望136-138
• 参考文献138-148
• 附录A 个人简历及发表文章目录148-150
• 致谢150

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 刘天中;张维;王俊峰;郎莹;张静;;微藻规模培养技术研究进展[J];生命科学;2014年05期

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 黄适;基于培养方法和454测序技术对微拟球藻共栖细菌群落的研究[D];上海师范大学;2011年

，

本文编号：1030686