红尾沙蜥适应低氧环境的生理和生化机制研究

发布时间：2017-10-16 06:16

  本文关键词：红尾沙蜥适应低氧环境的生理和生化机制研究

  更多相关文章： 沙蜥属 青藏高原 红尾沙蜥 低氧适应 低氧诱导因子 血管内皮生长因子 肌红蛋白 一氧化氮合酶 一氧化氮

【摘要】：红尾沙蜥(Phrynocephalus erythrurus)是世界上垂直分布最高的爬行动物,栖息于青藏高原北部海拔4500-5300m之间。青藏高原平均海拔4000m以上,是全世界最高的高原,低氧和寒冷是其主要的环境特征。在这样严酷的环境下,经过长期的自然选择,世居高原的动物表现出了一系列对高原环境独特的适应特征。本学位论文选用红尾沙蜥及低海拔分布的同属荒漠沙蜥(Phrynocephalus przewalskii)为研究对象,采用生理生化和分子生物学的方法从种间比较分析了两种沙蜥的心肺结构、心肌和骨骼肌毛细血管密度、肌红蛋白浓度、一氧化氮合酶活性和一氧化氮(NO)含量等方面的差异以及与低氧调控相关的基因如低氧诱导因子(HIFs)、血管内皮生长因子(VEGF-A)、肌红蛋白(Mb)、氧化氮合酶(NOSs)的表达情况来探究红尾沙蜥对高海拔低氧环境的适应特征。主要研究结果如下：与荒漠沙蜥相比,红尾沙蜥肺部毛细血管分支节点更多,毛细血管网孔更小,呈现规律性“正多边形”排列；同时,红尾沙蜥肺内部还具有更多独特的蜂窝状气室结构,这种构筑形式有效增大了毛细血管与肺泡的接触面积。由此可见,红尾沙蜥具有更复杂的肺部结构和更大的肺内表面积,这可能是红尾沙蜥提高气体交换效率的一种策略。与荒漠沙蜥相比,红尾沙蜥心肌和骨骼肌毛细血管分布更为丰富。组织毛细血管的增加是红尾沙蜥对低氧环境的适应特征之一,有利于血液和组织细胞的氧气转运。低氧诱导因子HIF-1α和HIF-2α在机体低氧适应过程中处于核心的调控地位,其下游靶基因VEGF-A的表达能够促进毛细血管的发生与形成。研究表明,低氧可以诱导上述基因的表达。但是在本实验中我们发现,与低海拔荒漠沙蜥相比,红尾沙蜥肺中HIF-1α和HIF-2α mRNA表达显著降低,分别下降了50.3%和65.1%(P0.001)；心肌和骨骼肌中两种基因的表达无种间差异。红尾沙蜥心肌和骨骼肌中VEGF-A mRNA的表达也明显低于荒漠沙蜥,肺中VEGF-AmRNA的表达两种沙蜥间无明显差异。这些结果表明红尾沙蜥中上述基因的表达不仅存在明显的组织特异性而且还具有独特的低氧响应钝化特征。与荒漠沙蜥相比,红尾沙蜥肺、心肌和骨骼肌毛细血管密度增加,但其调控基因VEGF-AmRNA表达水平并未上调,这可能是因为VEGF-A在红尾沙蜥中存在转录后调控。相关性分析发现,红尾沙蜥和荒漠沙蜥不同组织中HIF-1α、HIF-2αc和VEGF-A mRNA表达量之间并无一致的正相关性,这可能与上述基因均存在多重调控有关。另外,两种沙蜥HIF-1α、HIF-2α和VEGF-A编码区序列均出现氨基酸位点替换,这是否与高海拔环境适应有关还有待于进一步研究。Mb是重要的氧贮存和运输蛋白,低氧条件下在细胞供氧过程中发挥着重要的作用。本论文通过RACE-PCR克隆了红尾沙蜥和荒漠沙蜥Mb基因序列全长,比对发现了3个氨基酸位点替换,分别为Thr13Ile、Lys87Thr 和 His118Asn。通过同源建模分析两种沙蜥肌红蛋白三维空间结构发现,红尾沙蜥肌红蛋白heme pocket体积比荒漠沙蜥更大,这意味着更小的空间位阻,有利于氧气的结合和卸载。同时,红尾沙蜥心肌和骨骼肌中Mb mRNA的表达均明显高于荒漠沙蜥,分别是其表达量的2.4倍和3.1倍。红尾沙蜥骨骼肌Mb浓度也明显高于荒漠沙蜥,但心肌中无显著差异。另外,我们还发现两种沙蜥心肌中Mb mRNA表达量和蛋白浓度均约为骨骼肌中的2倍。上述结果与大多数动物中Mb低氧适应机制的研究结论一致。这些结果说明红尾沙蜥也采取了这一适应策略,利用较高的肌红蛋白来提高组织的供氧效率。NO是调节血管张力和结构最重要的内源性舒张因子,主要来源于L-Arg催化反应。该反应的唯一关键酶是一氧化氮合酶(NOS),主要有eNOS、nNOS和iNOS三种亚型。与荒漠沙蜥相比,红尾沙蜥心肌、肺和骨骼肌中eNOS mRNA的表达水平没有显著差异。红尾沙蜥心肌和骨骼肌中nNOS mRNA表达水平显著高于荒漠沙蜥,分别增加了248.9%和119.2%。肺中nNOS mRNA表达两种沙蜥没有差异。红尾沙蜥心肌iNOS mRNA表达显著高于荒漠沙蜥,约为其4.1倍。肺和骨骼肌中iNOS mRNA表达两种沙蜥无显著差异。与荒漠沙蜥相比,红尾沙蜥骨骼肌中总NOS酶活性明显下降而其他组织中没有差异。红尾沙蜥心肌和骨骼肌中iNOS酶活性显著低于荒漠沙蜥,分别下降了66.9%和46.7%。血清和肺中iNOS酶活性未表现出种间差异。红尾沙蜥血清、肺、心肌和骨骼肌中NO含量均显著低于荒漠沙蜥。这些结果表明红尾沙蜥心肌和骨骼肌中nNOS和iNOS mRNA的表达是选择性上调的,但其心肌和骨骼肌中iNOS酶活性却受到了抑制。我们推测这些特征可能与红尾沙蜥长期高海拔栖息地低氧环境有关,也是其重要的适应特征之一综上所述,作者认为红尾沙蜥在心肺结构和脉管系统及与低氧调控相关的基因表达等方面均表现出了一系列独特的生理和生化适应特征及分子调控机制,这些研究进一步丰富和完善了高原低氧适应机制研究的理论体系,有助于更好的保护高原生物多样性,同时也为高原医学研究和发展提供了参考。
【关键词】：沙蜥属 青藏高原 红尾沙蜥 低氧适应 低氧诱导因子 血管内皮生长因子 肌红蛋白 一氧化氮合酶 一氧化氮
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q494
【目录】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-14
• 第一章 陆栖脊椎动物高原适应研究概况14-23
• 1.1 呼吸系统对低氧的适应15-16
• 1.1.1 肺通气响应15-16
• 1.1.2 肺结构的改变16
• 1.2 心脏对低氧的适应16
• 1.3 氧运输系统16-17
• 1.4 代谢强度和酶活性对低氧的适应17-18
• 1.5 低氧响应基因的表达变化及调控18-23
• 1.5.1 低氧诱导因子19-20
• 1.5.2 血管内皮生长因子20-22
• 1.5.3 促红细胞生成素22
• 1.5.4 一氧化氮合酶22-23
• 第二章 青藏高原沙蜥属蜥蜴研究概况23-26
• 2.1 中国沙蜥属研究概述23-24
• 2.2 青藏高原沙蜥属蜥蜴研究24-26
• 第三章 红尾沙蜥心肺、脉管系统对高海拔低氧的生理适应26-39
• 3.1 引言26
• 3.2 材料26-29
• 3.2.1 样本采集26-27
• 3.2.2 主要试剂及配制27-29
• 3.3 实验方法29-31
• 3.3.1 肺组织显微结构29
• 3.3.2 心肌和骨骼肌毛细血管密度29-30
• 3.3.3 数据分析30-31
• 3.4 实验结果31-37
• 3.4.1 心肺重量和心肺重量与体重比31-32
• 3.4.2 肺组织显微结构观察32-34
• 3.4.3 心肌毛细血管密度34
• 3.4.4 骨骼肌毛细血管密度34-37
• 3.5 讨论37-39
• 第四章 红尾沙蜥HIFs和VEGF-A基因克隆及mRNA表达研究39-71
• 4.1 引言39
• 4.2 样品采集39-40
• 4.3 主要实验仪器及试剂40-42
• 4.3.1 主要实验仪器40
• 4.3.2 主要试剂40-41
• 4.3.3 主要溶液配制41-42
• 4.3.4 主要分析软件和在线分析程序42
• 4.4 实验方法42-52
• 4.4.1 红尾沙蜥和荒漠沙蜥组织总RNA提取42-43
• 4.4.2 去除总RNA中的基因组DNA43
• 4.4.3 RT-PCR cDNA第一链合成43-44
• 4.4.4 RACE-PCR cDNA合成44
• 4.4.5 红尾沙蜥HIF-1和VEGF-A基因序列扩增44-50
• 4.4.6 Real-time PCR50-52
• 4.5 结果52-67
• 4.5.1 不同组织总RNA提取52-53
• 4.5.2 HIF-1α和HIF-2α RT-PCR扩增53
• 4.5.3 HIF-1α和HIF-2α RACE-PCR扩增53-54
• 4.5.4 HIF-1α和HIF-2α cDNA序列生物信息学分析54-62
• 4.5.5 VEGF-A基因RT-PCR扩增62
• 4.5.6 VEGF-A cDNA序列生物信息学分析62-65
• 4.5.7 Real-time PCR内参基因的选择65
• 4.5.8 不同组织HIF-1α、HIF-2α和VEGF-A mRNA表达65-67
• 4.5.9 HIF-1α、HIF-2α和VEGF-A mRNA表达相关性分析67
• 4.6 讨论67-71
• 第五章 红尾沙蜥肌红蛋白对高原低氧的适应71-87
• 5.1 引言71
• 5.2 样品采集71
• 5.3 主要实验仪器和试剂71
• 5.4 实验方法71-73
• 5.4.1 肌红蛋白RT-PCR及RACE-PCR71-72
• 5.4.2 肌红蛋白序列分析72-73
• 5.4.3 肌红蛋白三维空间结构及同源建模评估73
• 5.4.4 肌红蛋白mRNA的表达73
• 5.4.5 肌红蛋白浓度的测定73
• 5.5 结果73-83
• 5.5.1 肌红蛋白RT-PCR和RACE-PCR73-74
• 5.5.2 肌红蛋白cDNA全长序列分析74-76
• 5.5.3 肌红蛋白氨基酸序列分析76-79
• 5.5.4 肌红蛋白三维空间结构与同源建模评估79-82
• 5.5.5 肌红蛋白mRNA表达82
• 5.5.6 肌红蛋白浓度82-83
• 5.6 讨论83-87
• 第六章 红尾沙蜥一氧化氮含量及一氧化氮合酶对高原低氧的适应87-104
• 6.1 引言87
• 6.2 样品采集87
• 6.3 主要实验仪器和试剂87
• 6.4 方法87-94
• 6.4.1 RNA提取及cDNA反转录87-88
• 6.4.2 eNOS、nNOS和iNOS基因的克隆88-89
• 6.4.3 eNOS,nNOS和iNOS Real-time PCR89-90
• 6.4.4 NOS酶活测定90-92
• 6.4.5 NO含量测定92-93
• 6.4.6 组织蛋白浓度的测定93-94
• 6.4.7 数据分析94
• 6.5 结果94-100
• 6.5.1 NOSs基因RT-PCR及序列分析94-96
• 6.5.2 两种沙蜥不同组织中eNOS、nNOS和iNOS mRNA表达水平96-98
• 6.5.3 iNOS和总NOS酶活性测定98-99
• 6.5.4 NO含量99-100
• 6.6 讨论100-104
• 6.6.1 长期的高原低氧适应增加了红尾沙蜥nNOS和iNOS mRNA的表达100-101
• 6.6.2 较低水平的iNOS酶活性是红尾沙蜥适应高原低氧环境的策略之一101-102
• 6.6.3 红尾沙蜥NO含量与长期的高原低氧适应间的关系102-104
• 第七章 结论与创新104-106
• 7.1 主要结论104-105
• 7.2 创新点105-106
• 参考文献106-119
• 在读期间发表论文情况119-120
• 学术交流与获奖情况120-121
• 学术交流120
• 获奖情况120-121
• 参与科研项目121-122
• 致谢122-124
• 附录124-151

【参考文献】

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本文编号：1041074