过氧化氢与一氧化氮互作调控小麦耐铝性的生理与分子机制

发布时间：2017-10-23 15:12

  本文关键词：过氧化氢与一氧化氮互作调控小麦耐铝性的生理与分子机制

  更多相关文章： 铝毒 小麦 过氧化氢 一氧化氮 蛋白激酶 抗氧化系统

【摘要】：全球大约30%的土地面积和50%的潜在可耕地面积属于pH低于5.5的酸性土壤。我国的酸性土壤主要分布在南方15个省区,约占耕地面积的21%。铝毒是酸性土壤上限制作物生长最重要的障碍因子。铝毒最典型的早期症状是根系伸长受抑制,影响植物对水分和养分的吸收,进而限制作物产量的提高,严重威胁全球的粮食安全。关于植物铝毒和耐铝性机理方面已作了大量研究,但对植物适应铝毒胁迫的信号调控机制尚不完全清楚。过氧化氢(H2O2)和一氧化氮(NO)是植物在逆境胁迫应答中起重要调节作用的关键信号分子,处于胁迫信号网络的中心环节,常同时出现且共同参与调控过程,并表现出相互协同性或依赖性。关于H2O2或NO单独对植物铝毒的缓解作用已有一些研究报道,但是关于H2O2和NO信号互作对植物耐铝性的调控作用及其分子生理机制尚少见研究报道。本论文以耐铝性差异明显的2个小麦基因型为材料,采用植物生理生化和分子生物学等技术相结合的方法,围绕铝诱导的NO早期猝发及其与耐铝性的关系、铝诱导产生的NO对小麦根尖AsA-GSH循环的影响及其与耐铝性的关系、铝诱导产生的NO对小麦根细胞壁特性的影响及其与根系伸长的关系、H2O2与NO互作在小麦适应铝胁迫中的作用及其机理、H2O2、NO和MAPK在铝胁迫诱导小麦根尖抗氧化系统中作用及其相互关系等方面进行了研究。取得的主要结果如下：1.采用组织染色和化学测定的方法,研究了铝胁迫下小麦根尖活性氧(ROS)、活性氮(RNS)以及抗氧化系统的变化。结果表明,根系伸长和活力均随着铝浓度的提高而降低,但鉴-864显著高于扬麦5号。30μM铝处理24 h后,鉴-864根尖O2、H2O2、NO、ONOO-的染色程度较轻；而敏感基因型扬麦5号根尖中O2、H2O2、NO、ONOO-的染色深度和荧光强度显著增加。细胞膜完整性(Evans blue染色)和膜脂过氧化(SchifF's reagent染色)结果表明,铝胁迫下扬麦5号根尖氧化损伤的程度显著高于鉴-864；而前者的抗氧化酶(CAT)活性和抗氧化物质(AsA、GSH)含量显著低于后者。因此,清除根尖过量积累的ROS和RNS,维持体内氧化还原稳态是其对铝毒胁迫耐性较强的重要原因。2.采用组织荧光染色法,研究了铝胁迫下小麦根尖不同时间NO含量的变化、来源及其与耐铝性的关系。结果表明,30州铝处理3h可诱导耐性基因型鉴-864根尖出现NO的早期猝发；而敏感基因型扬麦-5号无此NO信号,但12h后其NO含量显著增加。添加NO供体(SNP)可诱导敏感基因型扬麦5号根尖NO的早期猝发,降低胼胝质和ROS的含量,减轻铝对小麦根尖的氧化损伤,进而缓解铝对根系伸长的抑制。清除鉴-864根尖早期猝发的NO(添加NO专一清除剂,cPTIO)则加剧了铝对根系伸长的抑制效果。铝处理3h可显著提高鉴-864根尖硝酸还原酶(NR)活性,而对一氧化氮合酶(NOS)无明显影响。铝处理12h后扬麦-5号根尖NOS酶活性增加了3.5倍,而NR活性显著降低。NR抑制剂可完全抑制鉴-864根尖NO的早期猝发,而NOS抑制剂无此作用效果,但可明显降低扬麦5号根尖12h后NO的荧光强度。铝胁迫诱导鉴-864和扬麦5号根尖抗氧化酶活性的提高,但鉴-864显著高于扬麦-5号。NO供体可进一步提高铝胁迫下根尖抗氧化酶活性,而NO清除剂或NR抑制剂则显著降低了鉴-864根尖抗氧化酶活性。可见,铝诱导依赖于NR的NO早期猝发,可提高抗氧化酶活性,降低ROS的积累,减轻铝对根系造成的氧化损伤,从而增强小麦对铝毒的耐性。3.通过组织染色、化学测定结合根尖RNA提取及PCR技术,研究了铝胁迫下NO对AsA-GSH循环系统的调控作用。结果表明,铝胁迫抑制根系伸长,引起质膜过氧化损伤,促使还原型AsA和GSH转变为氧化型DHA和GSSG,且扬麦5号变化幅度较大。通过NO供体(SNP)诱导早期猝发的NO可显著缓解铝对小麦根系伸长的抑制,增加根尖还原型AsA和GSH的含量,提高AsA/DHA和GSH/GSSG的比值。铝胁迫显著提高了鉴-864根尖APX、GR和DHAR等酶的活性和基因表达水平,而对扬麦5号无显著影响。NO供体(SNP)处理显著提高了扬麦5号根尖上述酶的活性和基因表达水平。铝和NO处理对GSH合成酶γ-ECS的活性与表达无显著影响,但NO供体(SNP)显著增加了GSH代谢相关酶GPX和GST的活性。此外,铝胁迫显著降低了脯氨酸含量,而NO供体对其无显著影响。可见,NO通过提高AsA-GSH循环中主要酶活性,增强AsA-GSH循环的高效运行,促进AsA和GSH的循环再生,维持体内较高的AsA和GSH含量,清除过量积累的ROS,降低氧化损伤,从而缓解铝对根尖的氧化胁迫。4.选用铝胁迫下NO响应强烈的敏感基因型扬麦5号为材料,通过分级提取细胞壁组分、单克隆抗体结合免疫组织荧光、组织化学测定等方法,研究了铝诱导产生的NO对小麦根尖细胞壁组分和性质及铝毒效应的影响。结果显示,NO清除剂(cPTIO)可以显著缓解铝对扬麦5号根系伸长的抑制,降低根尖铝的积累。NO清除剂对铝胁迫下小麦根系苹果酸分泌及根际pH无明显影响。铝胁迫下扬麦5号根尖细胞壁果胶、半纤维素1和2的含量以及果胶甲酯酶活性显著提高,但果胶甲酯化程度显著降低。NO清除剂对铝胁迫下根尖细胞壁果胶、半纤维素1和2含量无影响,但显著降低了果胶甲酯酶活性,提高了果胶甲酯化程度。免疫组织荧光显示,NO清除剂提高了铝胁迫下根尖细胞壁高甲酯程度果胶含量,降低了低甲酯程度果胶含量,并显著降低果胶结合的铝含量。可见,铝诱导敏感小麦基因型(扬麦5号)根尖产生的高量NO,可通过提高果胶甲酯酶活性,降低果胶甲酯化程度,增加铝在细胞壁的积累,从而加剧铝对小麦根系产生的毒害效应。5.通过添加H2O2和NO供体和清除剂,研究了H2O2与NO在小麦根尖铝胁迫响应中的互作关系。结果表明,适当浓度的H2O2可以降低铝胁迫下小麦根尖的氧化损伤,缓解铝对根系伸长的抑制。H2O2供体可提高硝酸还原酶(NR)活性,并诱导铝胁迫下鉴-864和扬麦5号根尖NO的早期猝发；而H2O2清除剂或NADPH氧化酶抑制剂可抑制鉴-864根尖铝诱导的NO早期猝发和NR活性。一氧化氮合酶(NOS)抑制剂对铝胁迫下H2O2诱导的NO无显著影响,但NR抑制剂则完全抑制了铝胁迫下H2O2诱导的NO早期猝发。NO供体可缓解铝胁迫下H2O2清除剂对根系伸长的抑制,而H2O2供体不可以逆转铝胁迫下NO清除剂对鉴-864根系伸长的抑制效果。清除或抑制NO显著降低了铝胁迫下H2O2诱导的抗氧化酶活性,逆转H2O2对氧化损伤的缓解效果。表明铝胁迫下H2O2作为上游信号,诱导依赖于NR的NO早期猝发,提高植物体内抗氧化酶活性,降低ROS积累,从而增强小麦对铝毒胁迫的耐性。6.采用添加MAPK抑制剂、NO和H2O2供体等药理学方法,研究了H2O2、 NO和MAPK对铝胁迫诱导小麦根尖抗氧化酶活性的调控作用及其相互关系。结果表明,铝胁迫下耐性基因型鉴-864根尖抗氧化酶活性显著提高,而敏感基因型扬麦5号变化不大,MAPK抑制剂显著降低了鉴-864根尖抗氧化酶活性。H2O2和NO可以进一步提高铝胁迫下小麦根尖抗氧化酶活性,MAPK抑制剂则可显著抑制H2O2的作用效果,但对NO的作用效果无明显影响。进一步研究发现,MAPK抑制剂阻断了H2O2诱导的NR活性以及NO产生。表明,铝胁迫下根尖产生的H2O2可迅速激活MAPK级联,通过诱导依赖于NR的NO早期猝发,提高体内抗氧化酶活性,从而减轻铝对小麦根系造成的氧化损伤。
【关键词】：铝毒 小麦 过氧化氢 一氧化氮 蛋白激酶 抗氧化系统
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q945.78
【目录】：

• 致谢7-13
• 图目录13-15
• 摘要15-19
• Abstract19-23
• 第1章 文献综述23-50
• 1.1 植物铝毒机制24-25
• 1.1.1 植物铝毒的作用位点24
• 1.1.2 铝胁迫对植物的毒害机制24-25
• 1.2 植物耐铝机制25-27
• 1.2.1 外部排斥机制25-26
• 1.2.2 内部耐受机制26-27
• 1.3 过氧化氢和一氧化氮在植物适应铝毒等逆境胁迫中的作用机理27-46
• 1.3.1 过氧化氢(H_2O_2)27-33
• 1.3.1.1 H_2O_2的产生与清除28-29
• 1.3.1.2 H_2O_2参与的生物学过程29-30
• 1.3.1.3 H_2O_2信号对基因表达的调控30-31
• 1.3.1.4 铝胁迫下植物体内H_2O_2的响应及作用31-33
• 1.3.2 一氧化氮(NO)33-41
• 1.3.2.1 NO的合成途径33-35
• 1.3.2.3 NO与植物逆境胁迫35-38
• 1.3.2.4 铝胁迫下植物体内NO的变化及来源38-39
• 1.3.2.5 NO在植物适应铝胁迫的作用机制39-41
• 1.3.3 H_2O_2和NO在植物逆境响应中的相互作用41-46
• 1.3.3.1 H_2O_2和NO在气孔运动中的相互作用41-43
• 1.3.3.2 H_2O_2和NO在生物胁迫中的相互作用43
• 1.3.3.3 H_2O_2和NO在非生物胁迫中的相互作用43-44
• 1.3.3.4 H_2O_2和NO在调控基因表达中的相互作用44-45
• 1.3.3.5 MAPK介导的H_2O_2和NO的信号转导45-46
• 1.4 问题提出与技术路线46-50
• 第2章 铝对不同小麦基因型根尖活性氧和活性氮代谢的影响50-65
• 2.1 引言50-51
• 2.2 材料与方法51-55
• 2.2.1 植物材料与培养51
• 2.2.2 相对根伸长51
• 2.2.3 根系活力的测定51-52
• 2.2.4 根尖铝含量的测定52
• 2.2.5 ROS在小麦根系分布情况的显微观察52
• 2.2.6 Schiff's reagent和Evans blue染色52-53
• 2.2.7 NO和ONOO-含量的测定53
• 2.2.8 根系NADPH氧化酶活性测定53-54
• 2.2.9 抗坏血酸和谷胱甘肽含量的测定54
• 2.2.10 植物体内酶活性的测定54-55
• 2.2.11 基因表达分析55
• 2.3 结果分析55-62
• 2.3.1 铝胁迫对小麦根系伸长和根系活力的影响55-56
• 2.3.2 铝胁迫对小麦根尖铝含量的影响56-57
• 2.3.3 铝胁迫对小麦根尖O_2·~-和H_2O_2积累的影响57
• 2.3.4 铝胁迫对小麦根尖Schiff's reagent和Evans blue吸收量的影响57-58
• 2.3.5 铝胁迫对小麦根尖NADPH氧化酶的影响58-59
• 2.3.6 铝胁迫对小麦尖抗氧化系统的影响59-60
• 2.3.7 铝胁迫对小麦根尖NO含量的影响60-61
• 2.3.8 铝胁迫对小麦根系ONOO~-含量的影响61
• 2.3.9 铝胁迫对小麦根尖GSNOR活性的影响61-62
• 2.4 讨论62-64
• 本章小结64-65
• 第3章 铝诱导小麦根系NO的早期猝发及其与耐铝性的关系65-82
• 3.1 引言65-66
• 3.2 材料与方法66-70
• 3.2.1 植物材料与培养66
• 3.2.2 相对根伸长66
• 3.2.3 根系胼胝质的测定66-67
• 3.2.4 根系NO含量的测定67
• 3.2.5 根系ROS含量的测定67-68
• 3.2.6 根系组织染色68
• 3.2.7 根系H_2O_2的亚细胞定位68
• 3.2.8 根系细胞膜完整性、MDA和蛋白质氧化的测定68-69
• 3.2.9 硝酸还原酶(NR)和一氧化氮合酶(NOS)的测定69-70
• 3.2.10 抗氧化酶活性的测定70
• 3.3 结果分析70-78
• 3.3.1 铝胁迫下根尖内源NO的猝发70-71
• 3.3.2 NO供体对根系伸长和胼胝质积累的影响71-74
• 3.3.3 NO供体对根系ROS积累和氧化损伤程度的影响74-76
• 3.3.4 铝胁迫下小麦根尖NO的来源76-77
• 3.3.5 NO对小麦根尖抗氧化酶活性的影响77-78
• 3.4 讨论78-81
• 本章小结81-82
• 第4章 铝诱导产生的NO对小麦根尖AsA-GSH循环的影响及其与耐铝性的关系82-98
• 4.1 引言82-83
• 4.2 材料与方法83-87
• 4.2.1 植物材料与培养83
• 4.2.2 相对根伸长83
• 4.2.3 组织染色和亚细胞定位83-84
• 4.2.4 脯氨酸含量的测定84
• 4.2.5 抗坏血酸和谷胱甘肽含量的测定84-85
• 4.2.6 根系抗氧化能力的测定85
• 4.2.7 根系酶活性的测定85-86
• 4.2.8 总RNA提取和半定量RT-PCR86-87
• 4.3 结果分析87-95
• 4.3.1 NO供体对根系伸长及内源NO的影响87-89
• 4.3.2 NO供体对根系ROS和氧化损伤程度的影响89-90
• 4.3.3 NO供体对根尖抗氧化能力的影响90-91
• 4.3.4 NO供体对根尖脯氨酸含量的影响91-92
• 4.3.5 NO供体对AsA和GSH含量的影响92-93
• 4.3.6 NO供体对AsA-GSH循环酶活性和基因表达的影响93-94
• 4.3.7 NO供体对GSH代谢酶活性和基因表达的影响94-95
• 4.4 讨论95-97
• 本章小结97-98
• 第5章 铝诱导产生的NO对小麦根细胞壁特性的影响及其与根系伸长的关系98-111
• 5.1 引言98-99
• 5.2 材料与方法99-101
• 5.2.1 植物材料与培养99
• 5.2.2 相对根伸长和Evans blue染色99
• 5.2.3 根系铝含量的测定99
• 5.2.4 苏木精染色99-100
• 5.2.5 NO含量的测定100
• 5.2.6 根系有机酸的收集与测定100
• 5.2.7 细胞壁组分分级提取100-101
• 5.2.8 果胶甲基化程度的测定101
• 5.2.9 免疫荧光测定101
• 5.2.10 果胶甲酯酶的测定101
• 5.3 结果分析101-108
• 5.3.1 NO清除剂对小麦根系伸长和Evans blue吸收量的影响101-102
• 5.3.2 NO清除剂对小麦根尖铝含量的影响102-103
• 5.3.3 NO清除剂对小麦根系苹果酸分泌的影响103-104
• 5.3.4 NO清除剂对小麦根尖细胞壁组分的影响104-106
• 5.3.5 NO清除剂对小麦根尖果胶甲酯化程度的影响106-107
• 5.3.6 NO清除剂对小麦根尖果胶甲酯酶活性的影响107-108
• 5.4 讨论108-110
• 本章小结110-111
• 第6章 H_2O_2与NO互作在缓解小麦铝毒中的作用及其机制111-125
• 6.1 引言111-112
• 6.2 材料与方法112-114
• 6.2.1 植物材料与培养112-113
• 6.2.2 相对根伸长113
• 6.2.3 NO含量的测定113
• 6.2.4 根系Evans Blue吸收量和MDA含量的测定113
• 6.2.5 根系H_2O_2的亚细胞定位113
• 6.2.6 硝酸还原酶(NR)和一氧化氮合酶(NOS)的测定113
• 6.2.7 抗氧化酶活性的测定113-114
• 6.3 结果分析114-122
• 6.3.1 不同浓度H_2O_2处理对铝胁迫下根系伸长的影响114
• 6.3.2 H_2O_2处理对铝胁迫下氧化损伤的影响114-115
• 6.3.3 铝胁迫下内源H_2O_2含量的变化115-117
• 6.3.4 H_2O_2对根尖NO含量的影响117-118
• 6.3.5 H_2O_2诱导产生的NO的来源118-119
• 6.3.6 H_2O_2与NO在缓解根系伸长中的相互作用119-120
• 6.3.7 H_2O_2与NO在缓解氧化损伤中的相互作用120-121
• 6.3.8 H_2O_2与NO对根尖抗氧化酶活性的影响121-122
• 6.4 讨论122-124
• 本章小结124-125
• 第7章 MAPK、H_2O_2和NO对铝胁迫下小麦根尖抗氧化系统的调控作用及其相互关系125-133
• 7.1 引言125-126
• 7.2 材料与方法126-127
• 7.2.1 植物材料与培养126
• 7.2.2 NO含量的测定126
• 7.2.3 抗氧化酶活性的测定126-127
• 7.3 结果分析127-131
• 7.3.1 MAPK抑制剂对根尖抗氧化酶活性的影响127-128
• 7.3.2 MAPK抑制剂对铝胁迫下H_2O_2诱导的根尖抗氧化酶活性的影响128
• 7.3.3 MAPK抑制剂对铝胁迫下NO诱导的根尖抗氧化酶活性的影响128-129
• 7.3.4 MAPK抑制剂对铝胁迫下H_2O_2诱导根尖NO产生的影响129-130
• 7.3.5 MAPK抑制剂对铝胁迫下H_2O_2诱导的NR活性的影响130-131
• 7.4 讨论131-132
• 本章小结132-133
• 第8章 全文总结133-136
• 8.1 主要研究结论133-134
• 8.2 主要创新点134-135
• 8.3 研究展望135-136
• 参考文献136-154
• 攻读博士学位期间主要成果15

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