一类新非编码RNA的发现以及产生和功能的初探

发布时间：2017-10-29 18:12

  本文关键词：一类新非编码RNA的发现以及产生和功能的初探

  更多相关文章： 非编码RNA 环RNA Alu元件 AG-GT序列 circEIF3J circPAIP2 拷贝数 RNA二级结构

【摘要】：非编码RNA通过不同的路径来调控基因表达,它与许多生理活动和疾病有关。而环RNA作为非编码RNA的一种,30多年前就被发现了,但是人们当时只是把它当作一类转录本在发生错误剪接和拼接过程中形式的垃圾RNA分子。直到2013年人们才认识到环状RNA在哺乳动物细胞中是普遍存在的,其中有一类环RNA序列当中充满了小RNA的结合位点,可起到“海绵”的作用,能够在每个环RNA分子上结合大量的小RNA。已有的研究表明环状RNA在转录后调控中扮演着一个重要角色,环RNA已成为目前分子生物学领域的国际热点课题之一。本文正是在已有的关于环RNA研究的基础上,从实验上对环RNA进行了深入和细致的研究,取得了以下重要的成果：(1)在研究与调控pol Ⅱ转录的非编码RNA实验中,发现一类新的环RNA。选取其中15个进行实验验证。这类环RNA是不同于之前研究人员发现的。它是由外显子-内含子-外显子构成的,而连接部分必须是由两个外显子连接在一起的,中间是由内含子构成的。这类环RNA在不同细胞中表现出组织特异性。例如,CLTC mRNA在两种细胞中都有表达,但是circCLTC只在HeLa细胞中表达,而在HEK293细胞中是不表达。同时,我们检测了其中两个CircEIF3J和CircPAIP2在HeLa细胞中的拷贝数,分别大约为31个和22个。(2)对比这15个circular RNA的前后序列,发现其中有4个是有前后互补的Alu序列,还有4个虽然不是Alu序列,但是前后也有碱基互补的序列。通过构建circEIF3J和circPAIP2的四种不同目的片段的环RNA质粒,转染后来检测这两个环RNA在细胞和细胞核中的表达量,发现如果环RNA前后的互补序列越多,产生的circular RNA也越多,可能是这样很容易构成一个发卡结构,便于环RNA的剪切。但是我们却发现这些人工构建的circular RNA不会对它们parent基因的表达产生影响。(3)Alu元件作为为哺乳类动物所特有的的短散在元件,可能在对环RNA的产生过程当中起到非常重要的作用。所以,构建了一类全新环RNA质粒,在人类细胞中是不可能自然产生的。通过实验可以发现这四个质粒也能够产生环RNA的,但是跑胶的目的条带却是弥散的,推测是产生环RNA时剪切位点不同。(4)通过观察发现这类环RNA的衔接位点两端处都有AG-GT序列,这个序列是否对环RNA的产生或功能有影响了?构建了两批不同的质粒,一类是以GFP为报告基因的,一类是荧光素酶为报告基因的。通过实验发现,AG-GT序列对环RNA的产生没有影响,但是却对它的功能在一定的条件下有影响。最后预测了CircEIF3J和CircPAIP2的二级结构,因为在许多非编码RNA分子当中,RNA的二级结构对其正常功能的发挥有非常重要,有时候甚至于比序列重要。
【关键词】：非编码RNA 环RNA Alu元件 AG-GT序列 circEIF3J circPAIP2 拷贝数 RNA二级结构
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q522
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第一章 非编码RNA和长非编码RNA13-25
• 1.1 引言13-14
• 1.2 非编码RNA的分类14-17
• 1.3 非编码RNA的功能和作用17-19
• 1.4 长非编码RNA的简介19-25
• 1.4.1 长非编码RNA概述20-21
• 1.4.2 长非编码RNA的功能和作用机制21-24
• 1.4.3 lncRNA在疾病中的作用相关研究24-25
• 第二章 circular RNA25-35
• 2.1 引言25
• 2.2 circular RNA研究历史和现状25-28
• 2.2.1 circular RNA的发现和鉴定25-26
• 2.2.2 circular RNA的主要特征26-27
• 2.2.3 circular RNA的长度27-28
• 2.3 circular RNA的功能28-33
• 2.3.1 circular RNA的发生机制28-29
• 2.3.2 CDR1as/CIRS-7作为的miR-7海绵(sponge)29-31
• 2.3.3 内含子来源的circular RNA的功能31
• 2.3.4 circular RNA其他的可能功能和应用前景31-33
• 2.4 circular RNA在疾病发生中的作用和功能33-35
• 第三章 实验材料和方法35-63
• 3.1 实验材料35-46
• 3.1.1 质粒、菌株及细胞株35
• 3.1.2 主要仪器35-36
• 3.1.3 试剂和溶剂配制36-37
• 3.1.4 Primer和siRNA的设计序列37-46
• 3.2 实验方法46-63
• 3.2.1 细胞复苏46
• 3.2.2 细胞传代46-47
• 3.2.3 细胞冻存47-48
• 3.2.4 质粒构建48-54
• 3.2.5 T载构建以及蓝白斑筛选54
• 3.2.6 贴壁细胞转染54
• 3.2.7 细胞核提取54-55
• 3.2.8 RNA抽提55-56
• 3.2.9 DNase消化56-57
• 3.2.10 逆转录57-58
• 3.2.11 Quantitative reverse-transcription PCR58-59
• 3.2.12 luciferase荧光蛋白检测59-60
• 3.2.13 western blot检测 & protein blot60-63
• 第四章 结果和讨论63-87
• 4.1 有一类circular RNA是和pol Ⅱ联系在一起的63-72
• 4.1.1 验证其中15个circular RNA64-68
• 4.1.2 circular RNA的表达存在细胞特异性68-69
• 4.1.3 circular RNA的序列中是有exon-intron-exon组成的69-70
• 4.1.4 circular RNA在细胞中的拷贝数70-72
• 4.2 circular RNA过表达情况研究72-77
• 4.2.1 对15个circular RNA的前后序列进行比对72
• 4.2.2 四种circular RNA过表达质粒的构建72-74
• 4.2.3 四种质粒转染后,在细胞中过表达circular RNA的情况74-76
• 4.2.4 四种质粒转染后,在HEK293细胞核中过表达circular RNA的情况76
• 4.2.5 四种质粒转染后,过表达的circular RNA对parent gene的表达影响76-77
• 4.3 ALU元件对circular RNA的影响77-80
• 4.3.1 构建含有alu序列的质粒,检测是否成环77-79
• 4.3.2 质粒转染后,表达的circular RNA对报告基因的表达影响79-80
• 4.4 circular RNA的junction部分有AG-GT碱基对环功能的影响80-83
• 4.4.1 构建有无AG-GT序列的质粒80
• 4.4.2 第二批质粒转染后,在HEK293细胞核中过表达circular RNA的情况80-81
• 4.4.3 第一批质粒当中,AG-GT对报告基因GFP的表达影响81-82
• 4.4.4 第二批质粒当中,AG-GT对报告基因luciferase蛋白的表达影响82-83
• 4.5 circular RNA的二级结构83-84
• 4.6 讨论和结论84-87
• 第五章 总结和展望87-91
• 参考文献91-103
• 博士期间发表的论文103-105
• 致谢105

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