调控超长链脂肪酸合成关键基因对植物种子中脂肪酸组成的影响

发布时间：2017-11-02 22:35

  本文关键词：调控超长链脂肪酸合成关键基因对植物种子中脂肪酸组成的影响

  更多相关文章： 超长链脂肪酸 芥酸 神经酸 甘蓝型油菜 亚麻荠

【摘要】：超长链脂肪酸(Very Long Chain Fatty Acids,VLCFAs)是指碳原子数目超过18的脂肪酸。这类脂肪酸是真核生物必需的组成成分,其碳链的长度、不饱和程度以及头部结构的极性,为超长链脂肪酸的结构和功能的多样性提供了基础,在生物体中具有广泛的生理功能。除此之外,超长链脂肪酸还是重要的化工原料,在工业、医疗、保健等领域具有不同的应用价值。植物油作为清洁能源成为了超长链脂肪酸生产的主要原料,提高植物种子中超长链脂肪酸的含量也成为了重要的育种目标。本研究通过调控植物中超长链脂肪酸合成途径上的关键基因,来影响其种子中的脂肪酸组成,为提高植物种子中超长链脂肪酸的含量提供参考依据。我们以芥酸和神经酸为例,针对其合成途径的关键基因开展了研究,得到了以下结果:1.从甘蓝型油菜基因组中克隆得到了FAE1基因在A、C基因组中相对应的拷贝Bna A.FAE1和Bna C.FAE1。序列比对发现这两个拷贝的DNA序列之间存在21个多态性位点,但只有5个造成了氨基酸位点的差异。将克隆得到的Bna A.FAE1和Bna C.FAE1在亚麻荠种子中特异表达,发现异源表达Bna A.FAE1的种子中C22:1含量比异源表达Bna C.FAE1的种子中含量高,而异源表达Bna C.FAE1的种子中C22:0的含量比异源表达Bna A.FAE1的种子高,说明Bna A.FAE1对单不饱和脂肪酸的亲和力可能比Bna C.FAE1高,而Bna C.FAE1对饱和脂肪酸的亲和力可能比Bna A.FAE1高。但在拟南芥fad2/fae1双突变体和酵母细胞中表达这两个基因时时,没有观察到类似的现象。对甘蓝型油菜祖先种白菜型油菜和甘蓝种子脂肪酸组成的分析,也没有观察到类似的差异。2.利用油酸含量高且多不饱和脂肪酸含量低的甘蓝型油菜与高芥酸油菜杂交,将突变的FAD2和FAD3基因导入高芥酸油菜的基因组中,培育芥酸含量高且多不饱和脂肪酸含量低的油菜。为了避免向高芥酸油菜中导入突变的FAE1基因,我们开发了Bn FAE1基因的共显性标记,并结合本实验室已开发的Bn FAD2和Bn FAD3的分子标记,在F2群体中筛选得到了2株芥酸含量高且多不饱和脂肪酸含量低的油菜单株。通过对其后代连续观察和芥酸测定,确认我们得到了C18:2含量低于10%,亚麻酸含量低于5%,芥酸含量高于40%的高芥酸、低多不饱和脂肪酸的甘蓝型油菜,并验证了这3个分子标记的准确性。3.我们在甘蓝型油菜种子中超表达Bn FAE1基因,可以将芥酸的含量由47%提高到了60%。在甘蓝型油菜种子中反义抑制Bn FAD2基因的表达,可将亚油酸的含量从12%降低到了7-8%,并且提高了油酸和芥酸的含量。将Bn FAE1超表达油菜株系与反义抑制Bn FAD2表达油菜株系杂交,在其F2单株中获得了芥酸含量超过Bn FAE1超表达油菜亲本的单株,芥酸含量最高达到63%。在甘蓝型油菜中表达来自酵母的LPAAT基因SLC1和SLC1-1,以及甘蓝的Bo LPAT基因,都不能在甘油骨架的sn-2位添加芥酸。在甘蓝型油菜种子中共表达来自荷包蛋花的Ld LPAAT和Bna A.FAE1可以显著提高油菜种子中芥酸的含量。将Ld LPAAT和Bna A.FAE1以及Bn LPAAT的RNAi抑制表达盒结构在油菜种子中共表达,同样可以提高种子中芥酸含量。4.我们调查了脂肪酸碳链酶中KCR、HCD和ECR与KCS相结合对超长链脂肪酸生产的作用。我们将银扇草中能够生成神经酸的La KCS在亚麻荠种子中表达,可以在亚麻荠种子中合成其原本没有的神经酸,最高含量可以达到12%。将La KCS与拟南芥中的At KCR、At HCD和At ECR中的每个基因分别组合,构建3个种子特异双基因共表达载体,转化亚麻荠,发现其种子中神经酸的含量并没有得到进一步地提高。将La KCS和At KCR以及At HCD一起在亚麻荠种子中共表达,仍然不能进一步提高神经酸的含量。对发育种子脂肪酸含量的动态观察表明,三基因共表达植株中神经酸的含量在种子发育早期比La KCS单基因表达植株种子中的神经酸含量高。以上结果表明,根据超长链脂肪酸合成途径上关键基因的特点,通过对其表达的调控,可以提高超长链脂肪酸的含量。本研究为高含量超长链脂肪酸的育种提供了参考依据。
【关键词】：超长链脂肪酸 芥酸 神经酸 甘蓝型油菜 亚麻荠
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要10-12
• Abstract12-15
• 缩略词表15-17
• 文献综述17-39
• 1 超长链脂肪酸的生物学功能及应用17-20
• 1.1 超长链脂肪酸的生物学功能17-18
• 1.2 超长链脂肪酸的应用18-20
• 1.2.1 芥酸的应用价值18-19
• 1.2.2 神经酸的应用价值19-20
• 2 超长链脂肪酸的生物合成20-32
• 2.1 脂肪酸碳链延长酶23-28
• 2.1.1 KCS基因的研究进展23-27
• 2.1.2 KCR基因的研究进展27-28
• 2.1.3 HCD基因的研究进展28
• 2.1.4 ECR基因的研究进展28
• 2.2 三酰甘油的合成28-32
• 2.2.1 三酰甘油的生物合成28-31
• 2.2.2 LPAAT基因的研究进展31-32
• 3 多基因聚合技术32
• 4 高超长链脂肪酸作物的育种进展32-37
• 4.1 高芥酸育种进展33-36
• 4.1.1 过表达FAE1 提高芥酸含量33
• 4.1.2 引入对芥酸具有亲和力的LPAAT33-34
• 4.1.3 抑制FAD2 基因的表达为芥酸的合成提供足够的底物34-36
• 4.2 高神经酸育种进展36-37
• 5 新兴的油料作物——亚麻荠37-38
• 6 本研究的目的与意义38-39
• 第一章 甘蓝型油菜BnaA.FAE1 与BnaC.FAE1 的克隆及其底物特异性的研究39-66
• 引言39
• 1 本研究的目的与意义39-40
• 2 材料和方法40-56
• 2.1 实验材料40-44
• 2.1.1 植物材料40
• 2.1.2 载体和菌株40
• 2.1.3 酶类40
• 2.1.4 生化试剂与耗材40-41
• 2.1.5 引物合成与测序分析41
• 2.1.6 软件与数据分析41
• 2.1.7 实验仪器41
• 2.1.8 主要试剂的配制41-44
• 2.2 实验方法44-56
• 2.2.1 亚麻荠的生长条件44
• 2.2.2 拟南芥的生长条件44
• 2.2.3 植物种子总RNA提取及反转录c DNA44-46
• 2.2.4 植物总DNA提取46-47
• 2.2.5 甘蓝型油菜基因BnaA.FAE1 和BnaC.FAE1 的克隆与表达载体的构建47-52
• 2.2.6 亚麻荠的转化及阳性种子的筛选52-53
• 2.2.7 拟南芥的转化及阳性种子的筛选53-54
• 2.2.8 酵母的转化54
• 2.2.9 脂肪酸组成的气相色谱分析54-55
• 2.2.10 Acyl-CoAs的液相-质谱分析55-56
• 3 结果与分析56-63
• 3.1 甘蓝型油菜BnaA.FAE1 与BnaC.FAE1 的克隆及其序列差异性分析56-57
• 3.2 BnaA.FAE1 与BnaC.FAE1 在亚麻荠种子中特异表达对种子中脂肪酸组成的影响57-60
• 3.3 BnaA.FAE1 与BnaC.FAE1 转基因的亚麻荠发育的种子中的Acyl-CoAs组成分析60-61
• 3.4 将BnaA.FAE1 与BnaC.FAE1 在拟南芥fad2/fae1 双突变体中特异表达对其种子中脂肪酸组成的影响61-62
• 3.5 将BnaA.FAE1 与BnaC.FAE1 在酵母中异源表达对其脂肪酸组成的影响62-63
• 3.6 对白菜型油菜以及甘蓝种子中的脂肪酸组成的分析63
• 4 讨论63-65
• 5 本章小结65-66
• 第二章 甘蓝型油菜BnFAE1 分子标记开发以及高芥酸、低多不饱和脂肪酸甘蓝型油菜的创建66-79
• 引言66-67
• 1 本研究的目的和意义67
• 2 材料和方法67-71
• 2.1 实验材料67-69
• 2.1.1 植物材料67-68
• 2.1.2 载体和菌株68
• 2.1.3 酶类68
• 2.1.4 生化试剂与耗材68
• 2.1.5 引物合成与测序分析68
• 2.1.6 软件与数据分析68
• 2.1.7 实验仪器68
• 2.1.8 主要试剂的配置68-69
• 2.2 实验方法69-71
• 2.2.1 甘蓝型油菜的田间种植及杂交组合69
• 2.2.2 高油酸甘蓝型油菜BnFAE1 基因的克隆69-70
• 2.2.3 等位基因特异引物设计及PCR扩增70
• 2.2.4 脂肪酸组成的气相色谱分析70-71
• 3 结果与分析71-77
• 3.1 高油酸甘蓝型油菜亲本中BnFAE1 基因的克隆及突变位点分析71-72
• 3.2 甘蓝型油菜BnFAE1 的分子标记开发72-74
• 3.3 高芥酸/低多不饱和脂肪酸的油菜单株筛选74-77
• 4 讨论77-78
• 5 本章小结78-79
• 第三章 调控几个芥酸合成关键基因对油菜种子中脂肪酸组成的影响79-108
• 引言79-80
• 1 本研究的目的与意义80
• 2 材料和方法80-97
• 2.1 实验材料80-82
• 2.1.1 植物材料80
• 2.1.2 载体和菌株80
• 2.1.3 酶类80-81
• 2.1.4 生化试剂与耗材81
• 2.1.5 引物合成与测序分析81
• 2.1.6 软件与数据分析81
• 2.1.7 实验仪器81
• 2.1.8 主要试剂的配制81-82
• 2.2 实验方法82-97
• 2.2.1 甘蓝型油菜的生长条件82
• 2.2.2 亚麻荠的生长条件82-83
• 2.2.3 基因克隆与表达载体的构建83-89
• 2.2.4 甘蓝型油菜的遗传转化89-90
• 2.2.5 转基因植株的PCR阳性鉴定90
• 2.2.6 亚麻荠的转化及阳性种子的筛选90
• 2.2.7 转基因植株的Southern分析90-94
• 2.2.8 转基因植株的表达分析94-95
• 2.2.9 种子中脂肪酸组成分析95
• 2.2.10 三酰甘油中甘油骨架sn-2 位的脂肪酸组成分析95-97
• 3 结果与分析97-104
• 3.1 在甘蓝型油菜种子中特异超表达BnFAE1 对其脂肪酸组成的影响97-99
• 3.2 在甘蓝型油菜种子中特异抑制BnFAD2 的表达对其脂肪酸组成的影响99-101
• 3.3 将BnFAE1 超表达株系与BnFAD2 反义抑制株系杂交对其后代种子中脂肪酸组成的影响101
• 3.4 在甘蓝型油菜中表达酵母SLC1 和SLC1-1 以及甘蓝BoLPAAT对其种子中脂肪酸组成的影响101-102
• 3.5 在甘蓝型油菜种子中共表达LdLPAAT、BnaA.FAE1 以及RNAi抑制BnLPAAT的表达对其脂肪酸组成的影响102-104
• 4 讨论104-107
• 5 本章小结107-108
• 第四章 共表达脂肪酸碳链延长酶复合体不同成员基因对超长链脂肪酸含量的影响108-131
• 引言108-109
• 1 本研究的目的和意义109
• 2 材料和方法109-114
• 2.1 实验材料109-111
• 2.1.1 植物材料109
• 2.1.2 载体和菌株109-110
• 2.1.3 酶类110
• 2.1.4 生化试剂与耗材110
• 2.1.5 引物合成与测序分析110
• 2.1.6 软件与数据分析110
• 2.1.7 实验仪器110-111
• 2.1.8 主要试剂的配制111
• 2.2 实验方法111-114
• 2.2.1 亚麻荠的生长条件111
• 2.2.2 基因克隆与表达载体的构建111-113
• 2.2.3 亚麻荠的转化及阳性种子的筛选113-114
• 2.2.4 转基因植株的表达分析114
• 2.2.5 种子中脂肪酸组成分析114
• 2.2.6 Acyl-CoAs的液相-质谱分析114
• 3 结果与分析114-127
• 3.1 脂肪酸碳链延长酶基因的各种组合的载体转化亚麻荠114-115
• 3.2 在亚麻荠种子中仅异源表达LaKCS对其脂肪酸组成的影响115-116
• 3.3 在亚麻荠种子中At KCR、At HCD和At ECR中任意一个基因与LaKCS共表达对其脂肪酸组成的影响116-122
• 3.4 在亚麻荠种子中共表达LaKCS、At KCR和At HCD对其脂肪酸组成的影响122
• 3.5 各转基因亚麻荠株系中Acyl-CoA的分析122-124
• 3.6 各转基因亚麻荠株系发育种子中脂肪酸含量的动态观察124-127
• 4 讨论127-130
• 5 本章小结130-131
• 参考文献131-142
• 附录142-145
• 附录1142-144
• 附录2 作者简介和在读期间发表的论文144-145
• 致谢145-147

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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