工程乙酰辅酶A通路构建酿酒酵母高效合成平台

发布时间：2017-11-05 21:31

  本文关键词：工程乙酰辅酶A通路构建酿酒酵母高效合成平台

  更多相关文章： 体外重建体系 代谢工程 脂肪酸合成途径 甲羟戊酸途径 生物化工产品 3羟基丙酸 生物能源 脂肪酸及其衍生物 抗氧化剂 beta-胡萝卜素

【摘要】：乙酰辅酶A (acetyl-CoA)是微生物细胞内重要的前体分子,直接参与了包括三羧酸循环、脂类代谢、氨基酸代谢、萜类代谢在内的近200个生化反应。采用代谢工程和合成生物学策略改造乙酰辅酶A代谢通路合成不同的精细化学品是目前研究的热点。本文以3羟基丙酸、脂肪酸和beta-胡萝卜素为靶向产品,通过工程不同的代谢途径建立酿酒酵母平台细胞工厂用于生产乙酰辅酶A衍生的产品。3羟基丙酸在化工行业中是一种非常重要的化合物,该产品被美国能源部评定为12种平台化合物之一。由于3羟基丙酸具有一个羟基基团和一个羧基基团,使其成为一个非常优秀的化合物,可作为化工材料的建造基石。3羟基丙酸在化工行业有着巨大的市场需求,通过改造微生物高效合成3羟基丙酸近年来备受关注。到目前为止,通过工程改造不同的代谢途径均已成功合成3羟基丙酸,主要集中于甘油途径和丙二酰辅酶A途径,且以甘油途径研究最为广泛。而相对于甘油途径,丙二酰辅酶A途径有其独特的优势：(1)由于不同的C5和C6糖代谢均可合成中间代谢分子乙酰辅酶A,因此这些廉价且来源广泛的碳源可作为3羟基丙酸合成的原料；(2)从葡萄糖代谢合成3羟基丙酸在碳源利用和能量代谢上实现了很好的平衡,理论上可以实现很高的转化率。本文首次引入来源于Metallosphaera sedula的醇脱氢酶MCR和醛脱氢酶MSR用于合成3羟基丙酸。为了研究3羟基丙酸合成系统的基本生化反应,我们在体外建立了以乙酰辅酶A为底物合成3羟基丙酸的反应。通过滴定不同浓度的ACC, MCR和MSR,我们发现ACC和MCR对3羟基丙酸的合成速率影响较大,而MSR对3羟基丙酸的合成速率影响较小。另外,我们在体外分析了3羟基丙酸和脂肪酸合成的竞争关系。在体内,我们首先评估了大肠杆菌和三个酵母菌株合成3羟基丙酸的能力。随后我们在大肠杆菌中通过启动子文库调节了MCR蛋白的表达。最后我们通过不同的代谢工程策略进一步提高了菌株合成3羟基丙酸的能力。我们相信本文所述的工作对进一步研究乙酰辅酶A途径合成3羟基丙酸产品将会提供重要的参考价值。脂肪酸是生物燃料分子(如脂肪酸酯、脂肪烷烃和脂肪醇)的重要前体。在之前的研究中,本实验室已经建立了大肠杆菌脂肪酸体外合成体系。基于该体系,脂肪酸合成的限速步骤和基本生化性质被挖掘。随后我们将该工作拓展到更有工业应用价值的酿酒酵母中去,以期搭建更面向产业化的“细胞工厂”。酿酒酵母中的脂肪酸合成系统和大肠杆菌略存在些差异。细胞质中生成乙酰辅酶A的途径要略微繁杂。脂肪酸合成酶属于类型Ⅰ脂肪酸合成酶,是一个12聚体的大型复合物。最后的产物以脂酰-CoA形式释放,而不是类型Ⅱ中的脂酰-ACP。途径中的ACS和ACC受到转录调控和翻译后修饰。在酵母中,脂肪酸激活为脂酰辅酶A后可进行beta氧化。为了阻止该反应的进行,FAA1, FAA4和POX1基因被敲除。在三个基因同时被敲除后,脂肪酸的产量可以由出发菌株的48 mg/L提高到106 mg/L。在大肠杆菌的代谢工程改造中,硫酯酶被证明是至关重要的。因此来源于大肠杆菌、植物和酿酒酵母本身的硫酯酶被超表达,结果表明只有超表达酿酒酵母本身的硫酯酶后脂肪酸产量有明显提高,为115 mg/L。平行的,超表达前体乙酰辅酶A的供应可以提高脂肪酸产量至124 mg/L,而超表达脂肪酸合成的起始步骤(ACC1蛋白催化)并没有提高目标产物的产量。为了分析酿酒酵母中脂肪酸合成体系的主要限速步骤,酿酒酵母无细胞合成体系(cell-free)被成功建立。在酿酒酵母细胞萃取物中添加从酿酒酵母中纯化的ACC,底物乙酰辅酶A和反应需要的各种辅因子,没有脂肪酸产物被检测到。而在酿酒酵母细胞萃取物中滴定从大肠杆菌中纯化的ACC,脂肪酸产物可以被检测到。该实验结果说明在酿酒酵母中脂肪酸合成的第一步反应是该系统的主要限制性步骤。由于ACC的活性和磷酸化修饰有密切的联系,因此为了为之后研究提供理论基础,我们进一步鉴定了该蛋白磷酸化位点的修饰。使用的质谱仪主要是LTQOrbitrap XL和Triple TOFTM 5600+。通过和数据库比对,55个磷酸化位点被鉴定。之后通过MIDAS方法进行人工校对。最后14个磷酸化位点被鉴定。主要分布为：5个位于BC(生物素羧化酶)区,BCCP(生物素羧基载体蛋白)和CT(羧基转移酶)区各一个。其他7个位于连接区,且全部位于非活性位点。其影响机制虽然不是很清楚,但该工作为进一步研究奠定了很好的基础。beta-胡萝卜素是类胡萝卜素(Carotenoids)的一种,具有非常强的抗氧化性,可以预防、延缓和治疗某些疾病,尤其是癌症,同时也能提高机体的免疫功能。目前被广泛应用于食品、药品、化妆品和保健品行业,具有广阔的市场前景。天然提取的beta-胡萝卜素产率较低且纯化工艺复杂,需要花费大量的人力和物力。通过化学合成beta-胡萝卜素虽然成本较低,但是产生的毒副产物较多,难以达到食品级要求。因此通过微生物合成beta-胡萝卜素受到研究者广泛的青睐。我们首先特征性比较了酿酒酵母中半乳糖诱导相关启动子的表达强度,选取较强的诱导型启动子pGAL1, pGAL7, pGAL10和pGAL2用于控制beta-胡萝卜素合成相关基因的表达。随后通过敲除调控半乳糖相关的基因GAL80,实现诱导型启动子的组成型表达,使得构建的菌株无需添加诱导剂半乳糖可以合成beta-胡萝卜素产物。同时我们通过密码子优化合成来源于三孢布拉霉中beta-胡萝卜素合成相关的基因,成功实现了在异源真核宿主内进行表达。超表达了甲羟戊酸途径中的基因以提高前体异戊烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸的合成。通过这些技术,在摇瓶发酵中,构建的工程菌种能够合成45 mg/L的beta-胡萝卜素,同时产生29 mg/L的番茄红素。随后经过碳源的优化,工程菌株可以产生149 mg/L的总胡萝卜素(64 mg/L的beta-胡萝卜素和85 mg/L的番茄红素)。为了进一步提高产物beta-胡萝卜素的积累,我们建立了中间产物的绝对定量方法,并通过中间产物的积累为下一步代谢工程改造提供靶标。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q936

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 唐香山,张学文;酿酒酵母表达系统[J];生命科学研究;2004年S1期

2 李华;单祖华;王华;;二氧化碳对酿酒酵母生长代谢的抑制[J];科技导报;2008年05期

3 赵树全;刘悦才;江国托;;酿酒酵母菌体中辅酶Q_(10)的提取及测定方法[J];酿酒科技;2008年11期

4 张晓阳;李余动;吴雪昌;;酿酒酵母的“组学”技术研究进展及其在工程菌株构建中的应用[J];中国生物工程杂志;2011年08期

5 王陆;基因操纵着酿酒酵母的改良[J];遗传工程;1984年04期

6 毛小洪;蔡金科;;用重组DNA方法构建分解淀粉酿酒酵母的新进展[J];生物工程学报;1989年03期

7 周薇;;利用酿酒酵母生产谷胱甘肽[J];微生物学杂志;1989年02期

8 林影;高重焕;依田幸司;山崎真狩;;一种新的酸性磷酸酯酶基因在酿酒酵母中的表达[J];生物工程学报;1992年02期

9 郭世宜，宋林生，，王学，樊廷玉，王秀玲，赵素然，张自立;酿酒酵母超微结构观察方法的研究[J];南开大学学报(自然科学版);1994年01期

10 曾云中,左小明,吴雪昌,张冬妮,朱晓平,李卫旗;糖化酵母及酿酒酵母原生质体制备中若干条件的探索[J];杭州大学学报(自然科学版);1995年02期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 周峻岗;祁庆生;王鹏;;酿酒酵母糖基化过程基因工程改造[A];中国资源生物技术与糖工程学术研讨会论文集[C];2005年

2 杨继旺;李琳;黄耀熊;;酿酒酵母生长过程中活性变化的荧光分析[A];中国遗传学会“第十一届全国激光生物学学术会议”暨《激光生物学报》创刊廿周年庆祝会、第十届粤港生物物理研讨会暨2012年广东生物物理学术年会会议资料[C];2012年

3 张梁;石贵阳;王正祥;章克昌;;具有纤维二糖代谢途径的重组酿酒酵母的构建[A];中国资源生物技术与糖工程学术研讨会论文集[C];2005年

4 陈晓峰;江贤章;吴松刚;黄建忠;;脂肪酸碳链延长酶与脱饱和酶在酿酒酵母中共表达[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2010年学术交流会论文集[C];2010年

5 李生强;林琳;;扩展青霉脂肪酶基因在酿酒酵母中的表达[A];华东六省一市生物化学与分子生物学学会2006年学术交流会论文集[C];2006年

6 曹丹燕;刘欣;许琳;严明;;酿酒酵母醛糖还原酶的表达条件优化及纯化[A];第三届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集（上）[C];2006年

7 王庆杰;祁庆生;王鹏;;酿酒酵母表面表达蔗糖合成酶[A];中国资源生物技术与糖工程学术研讨会论文集[C];2005年

8 何才姑;江澍;朴英杰;;人自噬基因hATG12在酿酒酵母自噬过程中的作用[A];2007年中国解剖学会第十届全国组织学与胚胎学青年学术研讨会论文摘要汇编[C];2007年

9 龚婷;何飞;廖媛;高向东;;酿酒酵母Rho4 GTP酶调控机制的研究[A];2012年第五届全国微生物遗传学学术研讨会论文摘要集[C];2012年

10 鲍晓明;付加芳;陈蕾;王明鹏;;酿酒酵母胁迫转录因子Bdflp的功能研究[A];泛环渤海地区九省市生物化学与分子生物学会——2011年学术交流会论文集[C];2011年

中国重要报纸全文数据库 前4条

1 刘霞;计算机可操控酵母菌内特定基因开关[N];科技日报;2011年

2 治;酿酒酵母部分蛋白组图谱公布[N];医药经济报;2002年

3 本报记者 李清理;坚持走科技创新之路[N];中国证券报;2000年

4 于佳淼 李成群;安琪超级酿酒酵母及其应用技术[N];中国食品质量报;2005年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 王路雯;Spt15及转录本UTR重叠对酿酒酵母基因表达的调控研究[D];复旦大学;2012年

2 吕小妹;利用代谢工程改造大肠杆菌及酿酒酵母进行异戊二烯生物合成的基础研究[D];浙江大学;2015年

3 谢文平;代谢工程改造酿酒酵母生物合成类胡萝卜素的研究[D];浙江大学;2015年

4 刘宁;本土酿酒酵母对葡萄酒质量的影响及优良菌株的筛选[D];西北农林科技大学;2015年

5 孙恒一;多拷贝人/鲑嵌合降钙素在酿酒酵母中表达优化及安全性评价研究[D];中国海洋大学;2015年

6 赵伟军;工业酿酒酵母代谢工程改造强化S-腺苷-蛋氨酸生物合成的研究[D];浙江大学;2016年

7 李晓伟;工程乙酰辅酶A通路构建酿酒酵母高效合成平台[D];武汉大学;2015年

8 王付转;絮凝性酿酒酵母基因工程菌的构建与发酵[D];江南大学;2008年

9 李莉莉;酿酒酵母耐性机理的代谢组学研究[D];华南理工大学;2010年

10 张丽琳;酿酒酵母应对镉胁迫的分子机理研究[D];天津大学;2012年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 鲁柳柳;三种不同来源的抗菌肽基因分别在毕赤酵母和酿酒酵母中的表达[D];华南理工大学;2015年

2 熊志钦;构建甘氨酸裂解酶系基因敲除的酿酒酵母及其应用[D];华南理工大学;2015年

3 唐亮;三条谷胱甘肽生物合成途径在酿酒酵母中组合表达的研究[D];北京协和医学院;2015年

4 黎明;酿酒酵母镉反应机理及镉拮抗物筛选初步研究[D];西南交通大学;2015年

5 练梅华;GAL3敲除对酿酒酵母生理及乙醇发酵性能的影响[D];广西大学;2015年

6 张冰;酿酒酵母中分离提取谷胱甘肽(GSH)和S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)[D];北京化工大学;2015年

7 易晨峰;酿酒酵母不同生长周期细胞对乙醇胁迫的响应[D];北京化工大学;2015年

8 曾燕;以酿酒酵母为模式真菌初探吩嗪-1-羧酸杀抑真菌的机理[D];南京农业大学;2013年

9 梁波;金属硫蛋白基因酿酒酵母工程菌吸附铀(Ⅵ)、钍(Ⅳ)的研究[D];东华理工大学;2015年

10 李妍;微拟球藻基因NgAUREO1对酿酒酵母生长相关基因调控作用的研究[D];青岛大学;2015年

本文编号：1145998