深海沉积物细菌Pseudoaiteromonas sp.SM9913适应环境的生活方式及其生理与遗传机制

发布时间：2017-11-25 13:07

  本文关键词：深海沉积物细菌Pseudoaiteromonas sp.SM9913适应环境的生活方式及其生理与遗传机制

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【摘要】：在复杂的海洋生态系统中,异养细菌是溶解有机物和颗粒有机物的主要分解者,因此异养细菌在海洋生境的物质循环和能量流动中起到了非常重要的作用。海洋沉积物中存在大量从上层海水沉积而来的颗粒有机物,底栖细菌作为这些颗粒有机物的主要分解者,是沉积物中物质循环和能量流动的关键一环。研究底栖细菌的生活方式有助于了解其和海洋沉积物环境之间的相互作用,进而帮助我们理解底栖细菌对海洋沉积物环境的适应机制和其生态功能。但是,针对底栖细菌的生活方式的研究却罕有报道。Pseudoalteromonas sp. SM9913 (Ps. sp. SM9913)是分离自冲绳海槽表层沉积物的一株典型深海沉积物异养细菌。在前期研究中,实验室已经对该菌株的胞外蛋白酶系、胞外多糖和基因组等进行了研究。在前期研究的基础上,本文研究了Ps. sp. SM9913适应深海沉积物环境的生活方式。通过生理学、遗传学和转录组学的研究,我们初步揭示了Ps. sp. SM9913的生活方式的相关机制,并提出了其可能的生活方式模型。(1)深海沉积物细菌Ps. sp. SM9913颗粒附着的生活方式及其遗传机制在前期对Ps. sp. SM9913的胞外多糖的研究基础上,我们推测其在深海沉积物环境中可能具有颗粒附着的生活方式。通过测定与黏土颗粒的结合能力,我们发现Ps. sp. SM9913具有与浮游细菌Pseudoalteromonas. haloplanktis TAC125 (Ps. haloplanktis TAC125)相近的黏土结合能力,表明其可能具有颗粒附着的生活方式。而胞外多糖合成缺陷株ΔepsT的黏土颗粒结合能力则显著低于野生型,ΔepsT中基因epsT的回补表达能够使其颗粒结合能力恢复至野生型水平。这表明了胞外多糖在Ps.sp. SM9913的颗粒附着的生活方式中的重要作用。(2)深海沉积物细菌Ps. sp. SM9913的游动和群涌运动的表征前期对Ps. sp. SM9913的比较基因组学的分析发现其具有两套鞭毛系统,一个有37个基因的基因簇被认为是其侧生鞭毛基因簇,负责合成侧生鞭毛。而另外两个分别有34个和22个基因的基因簇被认为是其极生鞭毛系统,负责合成极生鞭毛。为验证基因组学分析的结果,我们首先检测了Ps. sp. SM9913的运动能力,结果表明其具有群涌和游动两种运动能力。我们利用倒置显微镜进一步对Ps. sp. SM9913的群涌菌落边缘进行了原位观察,发现其群涌菌落边缘的细胞排列在一个单细胞层中,且细胞在此单细胞层中随机运动,菌落之外的细胞则不能运动。这种群涌方式与之前报道的大肠杆菌和枯草芽苞杆菌的群涌方式不同。为确认Ps. sp. SM9913的游动和群涌运动的“运动器官”,我们利用原子力显微镜对Ps. sp. SM9913的游动状态和群涌状态的细胞进行了观察,结果表明游动状态的细胞具有单个短的极生鞭毛,而群涌状态的细胞则具有多条侧生鞭毛。这些结果验证了前期的基因组学分析的结果,并第一次较为系统地表征了一株海洋细菌的游动和群涌运动。(3)深海沉积物细菌Ps. sp. SM9913的游动和群涌的遗传基础为进一步验证侧生鞭毛基因簇和极生鞭毛基因簇分别为Ps.sp. SM9913的群涌运动和游动的遗传基础。我们利用基因敲除技术对Ps. sp. SM9913的基因组中两个鞭毛系统分别进行了破坏。在侧生鞭毛基因簇中,敲除了基因PSM_A0914和PSM_A0915后得到了侧生鞭毛缺失突变株△LF。运动性实验表明△LF丧失了群涌运动能力。在突变株△LF中回补被敲除的基因PSM_A0914和PSM_A0915后,其恢复了群涌运动能力。在极生鞭毛基因簇中,敲除了基因PSM_A2283、PSM_A2282和PSM_A2281后得到了侧生鞭毛缺失突变株△PF。运动性实验表明△PF丧失了游动能力。在突变株△PF中回补被敲除的PSM_A2283、PSM_A2282和PSM_A2281后,其游动能力恢复到野生株的水平。在突变株△PF中敲除了基因PSM_A0914和PSM_A0915后得到了侧生鞭毛和极生鞭毛都缺失的突变株APFALF。运动性实验表明APFALF丧失了游动和群涌运动能力。在APFALF回补了被敲除的基因PSM_A0914、PSM_A0915、PSM_A2283、PSM_A2282和PSM_A2281后,其游动和群涌运动能力都恢复至野生型水平。这些研究结果证实了Ps. sp. SM9913的群涌运动和游动的遗传基础分别是侧生鞭毛基因簇和极生鞭毛基因簇。(4)深海沉积物细菌Ps. sp. SM9913的游动和群涌运动的比较转录组学分析为进一步了解Ps.sp. SM9913的群涌运动与游动之间的相互联系和区别及相关调控机制,我们分别对这两种运动状态下的细胞进行了转录组测序并比较了两种状态下基因的差异表达情况。比较结果表明,差异表达的基因中有946个是在群涌运动状态中上调表达的,而在群涌运动状态中下调表达的基因仅有76个。基因组分析预测的侧生鞭毛基因簇中所有基因在群涌状态中都是上调表达的,且我们发现侧生鞭毛基因簇上下游共计3个基因也具有类似的上调表达。比对分析发现这3个基因也与鞭毛的合成组装有关,由此我们对基因组分析预测的侧生鞭毛基因簇作了进一步的补充完善。我们利用实时荧光定量PCR技术对转录组测序的结果进行了验证。结果表明,选取的4个侧生鞭毛基因簇中的基因皆是在群涌细胞中显著上调表达的；而3个极生鞭毛基因簇中的基因则都是在群涌细胞中略微下调表达的。实时荧光定量PCR的结果证实了我们的转录组测序结果是可靠的。转录组比较分析发现,编码甲基化受体趋化性蛋白的基因21个中有18个是在群涌状态的细胞中显著上调表达的。其中上调表达最明显的是基因PSM_A2360,其编码的蛋白的同源蛋白Tsr在Escherichia coli中已被证实参与到群涌运动的信号传递中。这说明在Ps. sp. SM9913中可能存在类似的信号途径。在Ps. sp. SM9913的群涌状态的细胞中,大量与第二信使环二鸟苷酸单磷酸(c-di-GMP)的合成、降解、相互作用有关的蛋白的编码基因显著地上调表达。且在Ps. sp. SM9913的侧生鞭毛基因簇中的基因PSM_A0906编码的蛋白是一个长133个氨基酸仅具有一个PliZ单结构域的蛋白,而蛋白中的PliZ结构域已被证明是可以与c-di-GMP结合的。这些结果暗示第二信使c-di-GMP可能参与到了Ps. sp. SM9913的运动性的调控中。编码三对双组分调控系统元件的6个基因在群涌细胞中是显著上调表达的,且这三对双组分调控系统元件在Ps. sp. SM9913的相近种Ps. haloplanktis TAC125是没有直系同源蛋白的。其中PSM_A0531和PSM_A0532组成的双组分调控系统可能直接调控Ps. sp. SM9913的侧生鞭毛基因簇的转录表达。第二对双组分调控系统由PSM_A2131和PSM_A2132组成,可能通过调节细胞内c-di-GMP的浓度参与到Ps. sp. SM9913的运动性调控中。PSM_B0075和PSM_B0076所组成的双组分调控系统可能通过群体感应调控Ps. sp. SM9913的运动性。铁载体受体蛋白和铁载体转运蛋白的编码基因在群涌状态的细胞中都显著地上调表达,而与铁储存相关蛋白和一些含铁蛋白的编码基因则在群涌状态的细胞中显著地下调表达。测定结果表明,我们所用的液体海水培养基中铁离子浓度为4.64±0.07μM。在群涌运动的培养中加入终浓度从1μM到10μM的FeCl3发现外源添加的FeCl3会抑制Ps. sp. SM9913的群涌运动,浓度越高的FeCl3抑制作用越明显。生长曲线测定实验表明在培养基中添加同样浓度的FeCl3并不影响Ps. sp. SM9913的正常生长。这些结果表明,环境中铁的缺乏可能会诱导Ps. sp. SM9913的群涌运动。比较转录组学的研究很好地补充了前期基因组学和遗传学的研究,初步揭示了Ps.sp.SM9913的游动和群涌两种运动方式的生理机制,为进一步详细研究其运动性的调控机制奠定了基础。(5)胞外多糖在Ps. sp. SM9913的群涌运动中的作用细菌菌落的粘液层对群涌运动有重要的作用,而胞外多糖是粘液层的主要组分之一。我们利用Ps. sp. SM9913的胞外多糖合成缺陷株ΔepsT研究了胞外多糖在其群涌运动中的作用。比较分析发现AepsT同样具有群涌运动能力但其群涌菌落大小明显小于野生型菌株,说明胞外多糖的缺失削弱了其群涌运动能力。定量分析Ps. sp. SM9913和ΔepsT的群涌运动菌落直径发现,野生型Ps. sp.SM9913的菌落扩张速度的变化趋势是先增大后减小,呈倒钟形。而突变株AepsT的菌落扩张速度在起初为最大,并呈逐渐减小的趋势。Ps. sp. SM9913的群涌运动具有起初的延迟期且是密度依赖的。而ΔepsT的群涌运动不具有延迟期,且不是密度依赖的。在群涌运动的培养基上添加surfactin可以回补ΔepsT的运动缺陷,其群涌运动菌落可以恢复至野生型大小但是其菌落直径的变化趋势与野生型有较明显的差异。而添加Ps. sp. SM9913所分泌的胞外多糖能够部分回补其群涌运动缺陷。这些结果表明胞外多糖在Ps. sp. SM9913的群涌运动具有一定的调控作用,能帮助我们理解胞外多糖在其生活方式中的意义。(6) Ps. sp. SM9913在深海沉积物中运动生活方式的模拟研究我们进一步用黏土模拟深海沉积物环境,分析了Ps. sp. SM9913及其突变株在黏土中的运动能力,并与浮游细菌Ps. haloplanktis TAC125进行了比较。比较Ps. sp. SM9913和Ps. haloplanktis TAC125在黏土中的运动能力发现,Ps. sp. SM9913在黏土中有较明显的运动能力,而Ps. haloplanktis TAC125在黏土中的运动能力则检测不到。鞭毛缺失突变株APF、ALF和ΔPFΔLF在黏土中的运动能力皆显著低于野生型,其中ΔPFΔLF在黏土中的运动能力最差。这些结果表明,Ps. sp. SM9913在深海沉积物环境中可能具有游动和群涌运动两种运动方式,而且极生鞭毛和侧生鞭毛驱动了这些运动。通过检索部分已测序的海洋细菌的基因组,我们发现具有两套鞭毛系统的现象在分离自深海沉积物的菌株中普遍存在。(7)深海沉积物细菌Pseudoalteromonas. sp. SM9913的生活方式的模型的提出总结本文中我们对Ps. sp. SM9913的生活方式的研究结果,我们提出了一个描述其生活方式的模型。在深海沉积物中,Ps. sp. SM9913可通过游动聚集于营养颗粒周围,并在胞外多糖的作用下附着于营养颗粒上或周围的黏土颗粒上。附着生活的细菌利用营养颗粒上的营养生长繁殖,由于细菌的生长繁殖使得局部的某些必需营养物质耗尽。为了快速逃离这个营养耗尽的区域去寻找新的营养颗粒,这些Ps. sp. SM9913细菌群体可能会表达出侧生鞭毛通过群涌运动逃离颗粒。当细菌离开颗粒表面进入颗粒间的间隙水中,细胞群体的运动可能会转换为游动,细胞利用游动通过间隙水到达下一个营养颗粒表面,进行附着生活。这个模型首次较为全面的描绘了深海沉积物细菌在其原位生境中可能的生活方式,为进一步研究深海沉积物细菌的环境适应机制和生态功能奠定了基础。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q93

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本文编号：1226106