Spt4:Spt5结合DNA以及抗体E9结合ErbB2的结构生物学研究
本文关键词：Spt4:Spt5结合DNA以及抗体E9结合ErbB2的结构生物学研究
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【摘要】：基因表达是一个复杂并且受到多重调控的精细过程,包括了转录、翻译和翻译后修饰三个过程,并受到多种蛋白质复合物的调控。基因表达的第一步是转录,由RNA聚合酶催化,将遗传信息从DNA传递到RNA。调节基因转录的蛋白质被称作转录因子,转录因子在原核、古核、真核三界中的保守程度并不高,但唯一例外的是Spt5/NusG家族。Spt5(原核中被称作NusG)是唯一在三界中都存在的转录因子。在古核和真核生物中,Spt5可以和Spt4形成稳定的异二聚体发挥功能；但在原核生物中并不存在Spt4的同源蛋白,因而NusG独自发挥功能。前人的工作已经证明,Spt4:Spt5复合物与RNA聚合酶直接相互作用,并结合在RNA聚合酶clamp结构域的coiled-coil模体上。Spt4:Spt5所处的这一位置位于DNA出口处,在这里,完成了转录的DNA重新形成双螺旋结构,并通过DNA出口排出。在本次工作中,我们通过核磁共振化学位移扰动和荧光偏振实验首次证实了Spt4:Spt5结合DNA的能力；并通过解析和分析MjSpt4:Spt5的晶体结构,猜测了一个位于Spt4:Spt5上可能的DNA结合区域；并从两套衍射数据解析的模型中捕捉到了Spt4:Spt5两种不同的构象,进而分析了两种构象对Spt4:Spt5结合DNA能力的影响；通过结合定点突变和荧光偏振实验,我们最终构建了一个Spt4:Spt5结合DNA的模型,进而构建了一个包含了RNA聚合酶、Spt4:Spt5复合物和DNA三个元素的RNA聚合酶DNA出口模型,并通过生化实验和计算机模拟验证了此模型的正确性。ErbB2隶属于酪氨酸蛋白激酶家族中的表皮生长因子受体亚家族,这类跨膜蛋白通过胞外结构域的二聚化激活其胞内区的酪氨酸激酶活性,进而互相催化对方的胞内结构域C末端尾巴并进一步激活下游信号通路。ErbB2负责调控包括细胞复制和凋亡的多条重要信号通路,其活性异常会导致乳腺癌等近十种癌症,并有着更高转移性。因而,近年来ErbB2成为了抗肿瘤治疗的重要靶标分子。中国科学技术大学的细胞与分子免疫学实验室近年来一直致力于抗ErbB2抗体的研发,并开发了一株具有抗肿瘤活性的人鼠嵌合抗体chA21。近期,该实验室完成了对chA21的人源化,并通过亲和力成熟技术制备了具有高亲和力的人源化抗ErbB2抗体E9。我们与细胞与分子免疫学实验室合作,通过X射线衍射方法解析了E9 scFv片段与ErbB2完整胞外结构域的晶体结构,确认了E9在ErbB2上的结合位置；并发现在抗原—抗体结合界面上,原先chA21所结合的抗原表面三条loop变成了两条,解释了E9亲和力提升的原因；结合ELISA和肿瘤细胞增长抑制试验阐明了抗体CDR区相对距离对E9抗肿瘤能力的影响,进一步补充了E9下调ErbB2模型的细节。
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78
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，本文编号：1250901
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