内生真菌稻镰状瓶霉基因敲除体系的构建及六个细胞自噬基因的功能分析

发布时间：2017-12-07 17:16

  本文关键词：内生真菌稻镰状瓶霉基因敲除体系的构建及六个细胞自噬基因的功能分析

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【摘要】：自然界中,植物与微生物通常形成互利共生的体系,这对植物的生长和自然生态系统都起着非常重要的作用。内生真菌是一类能广泛与植物互作并与植物保持平衡状态的一类微生物,其生活史中至少有一部分能侵入并且定殖在健康植物组织中,且不引起宿主植物发病。暗色有隔内生真菌是内生真菌中的一大类群,严格定殖在植物的根部,能够增强植物的抗逆性和抗病能力,同时能影响植物的群落。稻镰状瓶霉Harpophorn oryzae是从疣粒野生稻分离得到的一种典型暗色有隔内生真菌,定殖在水稻根部,能够促进水稻的生长,并提高水稻抗生物和非生物胁迫能力。研究稻镰状瓶霉与水稻互作的分子机制有助于更好地利用该共生体系。细胞自噬autophagy是在真核生物(从酵母到人类)中具有高度进化保守性的一类亚细胞降解途径,研究表明该过程与许多植物病原真菌的侵染有关。本研究的创新点在于研究细胞自噬过程是否影响稻镰状瓶霉在水稻中的定殖从而影响共生体系。本研究基于稻镰状瓶霉基因组序列测定结果,探索适用于稻镰状瓶霉的基因功能研究的方法,并且对六个自噬相关基因的功能做了深入的分析。主要研究结果如下：1)自噬相关基因的生物信息学分析根据酵母和稻瘟病菌自噬相关基因的氨基酸序列,在17种真菌(包括两种卵菌)中找到细胞自噬过程和调节自噬过程的基因的同源序列,并对它们的进化关系进行分析,着重对稻镰状瓶霉中自噬相关基因进行详细鉴定和分析。2)探索稻镰状瓶霉中基因功能研究的方法使用目的基因敲除的方法来研究稻镰状瓶霉中的基因功能,探索并优化适合稻镰状瓶霉的基因敲除体系。成功获得HoATG1、HoATG5.HoATG7、HoATG8、 HoATGl2和HoATG16共6个自噬相关基因的缺失突变体。3)六个基因均参与稻镰状瓶霉的细胞自噬过程六个基因的缺失突变体均对饥饿敏感,通过光学显微镜和透射电镜的观察发现,六个基因HoAG1、HoATG5、HoATG7、HoATG8.HoATG12和HoATG16的缺失突变体在饥饿诱导的条件下菌丝液泡内无自噬小体积累,细胞自噬过程被阻断。4)稻镰状瓶霉中不同基因同酵母、稻瘟病菌的保守性验证稻镰状瓶霉中的HoATG5.HoATG8能够回补稻瘟病菌突变体△Monatg5口ΔMoatg88的表型,证明两个自噬基因与稻瘟病菌中的自噬基因具有结构和功能上的同源性；通过酵母双杂交实验发现,稻镰状瓶霉中HoAtg5-HoAtg3,HoAtg5-HoAtg16,HoAtg7- HoAtg8,HoAtg7- HoAtg12,HoAtg8-HoAtgl之间能发生互作,结果与酵母中一致,说明在稻镰状瓶霉中同样有着保守的泛素样蛋白结合系统。5)自噬相关的三个基因对水稻共生体系无影响三个突变体△Hoatg5、△Hoatg7和△Hoatg8与水稻进行共培养的结果显示,三个基因缺失突变体在促生效果上与野生型一致,说明三个基因fAoATG5. HoATG7和HoATG8与水稻促生无关；三个突变体在水稻根部定殖的结果显示,三者都能够定殖在水稻根部并且产生典型的侵染结构：暗色有隔菌丝、厚垣孢子及其萌发产生的芽管及侵染钉,最终都能够形成暗色有隔内生真菌特有的微菌核结构,证明三个基因HoATG5.HoATG7和HoATG8与根部定殖无关。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S182;S511

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本文编号：1263151