可逆永生化绵羊成纤维细胞系的建立及其应用研究

发布时间：2017-12-08 07:04

  本文关键词：可逆永生化绵羊成纤维细胞系的建立及其应用研究

  更多相关文章： 人端粒酶逆转录酶基因 永生化 绵羊 体细胞 Tet-on

【摘要】：体外培养的动物细胞在生物学研究、细胞治疗、转基因及动物克隆等领域均有非常重要的应用价值。但是,从动物组织分离的原代细胞增殖寿命有限,不利于体外连续传代培养,从而也不利于它们在基因打靶、转基因克隆等领域的应用。研究证明,在正常体细胞中异位表达人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)可以重构端粒酶活性,延长细胞寿命。然而,组成型表达hTERT会导致克隆胚胎发育停滞等问题。因此,本文试图通过条件性表达hTERT,建立可逆永生化绵羊成纤维细胞系,用于今后家畜体细胞转基因克隆及其它生物学研究。基于Tet-on系统,构建了hTERT可诱导表达质粒载体pTet-onhTEKT。利用电击转染的方法,将线性化的pTet-on hTERT转染到绵羊胎儿成纤维细胞中。在Dox (doxycyline)的诱导下,最终获得了6个稳定表达hTERT的细胞克隆。6个细胞克隆从96孔板扩增到60mm时,各分成两组：一组培养液中持续添加Dox,记为h(+)组；一组培养液中撤销Dox,记为h(-)组。用RT-PCR和Western blot分别检测了两组细胞中hTERT mRNA和hTERT蛋白质的表达水平,检测结果显示h(+)细胞中高表达hTERT mRNA和hTERT蛋白质。用TRPA (telomeric repeat amplification protocol)法检测了两组细胞中的端粒酶活性,结果证明在h(+)细胞中能够重构端粒酶活性。经过120天的连续传代培养,h(-)组细胞种群增长速率逐渐变慢直至衰老死亡,而h(+)组细胞种群增长速率一直保持稳定且细胞状态良好。这些结果证明了,异位表达hTERT能够使绵羊胎儿成纤维细胞永生化。随后,将h(+)组细胞又分成两组：一组培养液中仍添加Dox,仍记为h(+)组：另一组培养液中撤销Dox,记为h(+-)组。又经过130天的连续传代培养,h(+)组细胞种群增长速率仍保持不变且细胞状态良好,而h(+-)组细胞种群增长速率逐渐变慢且细胞形态扁平,证明了撤销Dox能够使永生化细胞发生逆转。对连续传代培养共250天左右的h(+)组细胞进行软琼脂克隆形成实验和染色体核型分析,结果证明永生化细胞未发生恶性转化。除此之外,将肌分化因子MyoD转染连续传代培养200天的h2(+)细胞。经过又一轮的细胞克隆筛选后,得到13个整合了MyoD的细胞克隆。通过RT-PCR,检测了这13个克隆中MyoD及其它肌肉特异性基因的表达。这一实验表明,寿命延长的h(+)细胞可以进行再一轮的转基因操作,因此可用于基因修饰和基础细胞学研究等。成年成纤维细胞较胎儿成纤维细胞取材更方便且不涉及伦理问题,更重要的是成年成纤维细胞作为核供体可以用于优良性状动物个体的克隆以及珍稀和濒危动物的扩繁及保种。但是,与胎儿成纤维细胞相比,成年成纤维细胞的增殖能力更差,核移植效率也更低。为了解决这一问题,本文又将pTet-on hTERT转染成年绵羊成纤维细胞,筛选得到了寿命延长的细胞克隆A3h38(+)。用连续传代培养136天的A3h38(+)细胞与原代成年成纤维细胞分别进行细胞集落形成实验,结果表明,A3h38(+)细胞的单细胞集落形成能力及集落扩增能力都显著高于原代成年绵羊成纤维细胞。然后,用连续传代培养80天的A3h38(+)细胞与原代成年成纤维细胞分别作为核供体进行核移植,结果显示A3h38(+)细胞作为核供体的克隆胚胎囊胚率比原代成年成纤维细胞显著提高。因此,建立永生化成纤维细胞系将为家畜体细胞的基因修饰及转基因克隆提供宝贵材料。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q813

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 魏海峰;井玲;魏雁虹;刘辉;齐玲;赵志涛;张秀云;李才;;氟对二维和三维培养的成纤维细胞胰岛素样生长因子-1表达的影响[J];中国生物制品学杂志;2010年05期

2 陈春明;在淋巴细胞和成纤维细胞培养中脆性X染色体的表达——一种新的技术[J];国外医学.遗传学分册;1982年05期

3 陈若泽;甘小敏;梁莹;唐德思;莫肖敏;;成纤维细胞形态学变化的电镜观察[J];电子显微学报;1988年03期

4 Ludmia ;胡子南;;用成纤维细胞培养检查重金属污染的牛组织[J];农业环境与发展;1991年03期

5 唐展云,陈诗书;基因工程成纤维细胞的研究进展[J];生命的化学(中国生物化学会通讯);1997年01期

6 王伟铭,周同,姚建;成纤维细胞及其异质性研究进展[J];生命科学;1997年03期

7 崔玉芳,杨红,高亚兵,熊呈琦,夏国伟,王德文;5-羟色胺对正常和受照射成纤维细胞生长的影响[J];辐射研究与辐射工艺学报;1998年03期

8 刘涛;金岩;王新文;黄沙;姜玲;温宁;;成纤维细胞上清提取物对成纤维细胞增殖迁移的影响[J];牙体牙髓牙周病学杂志;2006年03期

9 刘瑞丰,张际绯,李月珍;成纤维细胞复合染料染色法[J];解剖学杂志;1997年04期

10 王丹茹,钱云良,许礼根,杨群;γ干扰素对创面成纤维细胞的生物学影响[J];中华医学美容杂志;2000年06期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 李继坤;薛小平;杨秀竹;李东华;张艳萍;郭世铎;;中药调控成纤维细胞活性的实验研究[A];第七届全国中西医结合普通外科临床及基础研究学术会议论文汇编[C];2001年

2 刘杰峰;赵超莉;龙忠恒;许幼文;谢挺;;抑瘢檫剂对成纤维细胞的生物学的作用[A];第八届全国烧伤外科学年会论文汇编[C];2007年

3 陈若泽;甘小敏;梁莹;唐德思;莫肖敏;;成纤维细胞形态学变化的电镜观察[A];第五次全国电子显微学会议论文摘要集[C];1988年

4 杨庆;王兴桂;李程;刘峰;陈波;;基本机械力学刺激对腧穴筋膜成纤维细胞力感受器分子整合素α1、α3亚基表达影响研究[A];中国针灸学会经络分会第十二届全国针灸经络学术研讨会论文集[C];2012年

5 刘定志;肖衡;杜成友;罗诗樵;;肿瘤上清液激活成纤维细胞后对血管内皮生长因子-A表达影响[A];2012中国器官移植大会论文汇编[C];2012年

6 辛国华;罗旭;张友来;万子杨;曾元临;;改良五黄油对成纤维细胞生长增殖的影响[A];中华医学会烧伤外科学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年

7 李金玺;刘旭盛;唐辉;周新;黄跃生;;部分创面外用抗菌药物与碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、重组人生长激素对成纤维细胞生物学特性影响的实验研究[A];第五届全国烧伤救治专题研讨会烧伤后脏器损害的临床救治论文汇编[C];2007年

8 王春霞;曾煦欣;霍启录;侯连兵;;常通口服液对正常及粘连腹膜成纤维细胞周期的影响[A];2009年中国药学大会暨第九届中国药师周论文集[C];2009年

9 王春霞;曾煦欣;霍启录;侯连兵;;常通口服液对正常及粘连腹膜成纤维细胞周期的影响[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年

10 梁洋;杨莹;毛巍巍;安铁洙;;4℃下保存的小鼠胎儿成纤维细胞传代培养[A];中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十四次学术研讨会论文集[C];2006年

中国重要报纸全文数据库 前6条

1 本报记者 孟刚;帮你认识高机能水[N];中国消费者报;2009年

2 记者 刘海英;英发现成纤维细胞具有不同类型[N];科技日报;2013年

3 刘霞;美成功将成纤维细胞直接变为心肌细胞[N];科技日报;2010年

4 胡其峰;世界首例胎兔体细胞克隆实验获成功[N];光明日报;2007年

5 邹争春　朱广平;新型组织修复基因具有双重作用[N];中国医药报;2011年

6 暨南大学医药生物技术研究开发中心 李校X 姚成灿;bFGF肌肤“装修”揭秘[N];医药经济报;2001年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 庄卓男;整合素αVβ6与癌相关成纤维细胞的关系及恶性肿瘤细胞生物学行为研究[D];山东大学;2015年

2 简天明;吡非尼酮抑制眼眶成纤维细胞应力纤维及粘着斑重构作用和细胞功能的实验研究[D];天津医科大学;2015年

3 徐卓;成纤维细胞生长因子家族在肾脏疾病中的作用和机制研究[D];南京医科大学;2014年

4 刘方兰;TGF-β1在乳腺癌微环境诱导肿瘤相关成纤维细胞形成的机制研究[D];暨南大学;2016年

5 孟繁兴;鹅细小病毒非结构蛋白NS1与鹅胚成纤维细胞蛋白互作的研究[D];吉林农业大学;2015年

6 陈攀攀;缺氧预处理的骨毮间充质干细胞通过瘦素抑制心脏成纤维细胞活化和胶原合成[D];浙江大学;2016年

7 陈泽林;机械创伤对成纤维细胞干性和辐射反应性的影响及其与组织修复再生的关系[D];第三军医大学;2016年

8 张娜;可逆永生化绵羊成纤维细胞系的建立及其应用研究[D];中国农业大学;2016年

9 屈纪富;合并全身放射损伤创伤局部成纤维细胞变化的机制与意义的研究[D];第三军医大学;2001年

10 孟国林;成纤维细胞成骨能力的系列研究[D];第四军医大学;2000年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 廖纯颖;奶牛乳腺成纤维细胞中TLR、NOD及其信号通路相关基因mRNA表达检测[D];四川农业大学;2014年

2 于健;成纤维细胞内质网应激反应与人工关节磨损微粒间关系的实验研究[D];南京大学;2014年

3 孔亚男;MAPK信号通路介导活化素A、B对成纤维细胞的调控[D];南方医科大学;2013年

4 毛书雷;外源性硫化氢对烧伤大鼠皮肤成纤维细胞周期的影响[D];青海大学;2016年

5 马迁;烧伤大鼠创面成纤维细胞硫化氢/胱硫醚-γ-裂解酶体系变化的研究[D];青海大学;2016年

6 陈晶晶;非病毒多基因纳米传递与成纤维细胞的神经分化研究[D];江苏大学;2016年

7 秦海燕;UVA辐射诱导成纤维细胞损伤过程中PcG蛋白的作用研究[D];吉林大学;2016年

8 文孝婷;衰老间质成纤维细胞对人结肠癌LoVo细胞生物学特性的影响[D];苏州大学;2016年

9 毛熙贤;TGF-β1信号在成纤维细胞促血管生成中发挥重要作用[D];重庆医科大学;2016年

10 徐盛权;人皮肤成纤维细胞在缺氧应激下TGF-β通路及Toll样受体相关蛋白表达变化[D];浙江大学;2016年

，

本文编号：1265454