异养细菌硫化物氧化途径及产物分析

发布时间：2017-12-09 01:09

  本文关键词：异养细菌硫化物氧化途径及产物分析

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【摘要】：硫化物与地球上生命的出现有着千丝万缕的联系,硫化物与酸性含铁的水相互作用促进了胶体性铁硫蛋白膜的出现,被认为大大提高了第一个有机物合成事件的频率。从许多古代化石中可以发现,有许多化能自养的生物是以硫化合物为基础能源生活的,直到现在,硫化物继续影响着许多生物的生长,而且硫在微生物生物质中是第6大丰富的元素,因此硫和硫化物的代谢对于地球化学循环至关重要。环境中H2S主要是由硫酸盐还原作用,火山作用等产生,在生物体内也产生,主要来源于氨基酸的代谢。由各种方式产生的H2S还可以释放到环境中,而且海洋中也会产生许多含硫化合物,例如气态的H2S和SO2等都会释放到空气中。多余的H2S会污染空气,SO2会造成酸雨等众多环境质量问题。一般H2S的去除是氧化到硫酸盐,之后被植物利用,从而完成硫循环的关键步骤,而自然界中H2S的氧化主要是靠微生物的作用,尤其是一些硫氧化细菌和古生菌。H2S的毒性与其浓度密切相关,在高浓度时会对生物产生神经性的毒性,而在低浓度时可以起到重要的生理功能,如在哺乳动物中,高浓度的H2S会导致中毒,但低浓度H2S则可以调节各种生理功能等,由此H2S被认为是继NO和CO后的第三种气体信号分子。维持H2S的浓度对于生物来说至关重要,生物中过多的H2S主要是通过酶的联合作用发生氧化而去除的。在哺乳动物线粒体中包含了一套重要的酶系统,该系统由硫醌氧化还原酶(SQR),过硫化物双加氧酶(PDO)和硫转移酶(ST)组成,这3个酶进行联合作用,将H2S代谢为硫代硫酸盐,该系统的代谢路线已经被报道,但对于H2S的氧化途径仍存在着一些不清楚的问题。这些问题主要集中在(1)硫醌氧化还原酶氧化H2S的产物一硫烷硫,具体是什么形式的?在真核生物线粒体中SQR的活性需要有硫烷的受体,是否在所有的生物中都需要?如果需要,受体是什么?现有的报道认为谷胱甘肽,半胱氨酸,亚硫酸盐都可能作为受体,但真正的生理受体并不清楚；(2) SQR/PDO/ST这套系统在异养细菌中是否存在?如果存在,其作用是否和真核生物中相似?(3)在异养细菌中是否存在与真核生物不同的还原性无机硫化合物的代谢途径?其生理意义是什么?(4)在微生物中的研究大多都集中在自养型细菌中,在异养细菌中的研究较少,但是由于异养细菌广泛的分布、数量的优势以及生长繁殖的快速等优势,使得它代谢H2S的速率可能更快,这可能具有重要的生态学意义。为了解决以上提出的问题,本文重点放在异养细菌H：S的生物氧化上,以大肠杆菌作为载体研究了SQR/PDO/ST系统的酶学、氧化H2S的能力、途径以及产物等,或直接在野生菌Cupriavidus pinatubonensis JMP134中研究代谢H2S的情况。具体研究了以下内容：(1) 利用已经发现的过硫化物双加氧酶(PDO)基因作为查询序列,通过BLAST程序,在已经测序的细菌基因组中,寻找是否有存在于细菌中的过硫化物双加氧酶。结果发现该酶的同源蛋白质广泛存在于细菌中,并主要集中在变形菌门和蓝细菌门,约占已经测序细菌基因组总量的20%；根据多序列比对,将新发现的与已经报道的蛋白质进行了系统发育树的构建,以此将可能的过硫化物双加氧酶分为3类：PDO1, PDO2和Blh,并且这3类与GloB1和GloB2的亲缘关系较近,后两者都是乙二醛酶。已经报道的MxPDO1和PpPDO2的结构解析显示PDO1和PD02在底物结合位点上的区别,从而说明了本文对于PDO的分类的准确性。从这3类PDO以及GloB1和GloB2中共挑取了14个蛋白质,利用GSSH作为底物对其酶活性进行了鉴定,发现有8个酶具有过硫化物双加氧酶活性,分别属于PDO1, PDO2和Blh这三类,其中以MxPDO1 a催化效率最高,在GloB1和GloB2中选择的蛋白质均没有活性,与我们用进化树进行预测的结果相吻合。通过ICP-MS检测了CpPDO2等酶的重金属组成,发现它含有与蛋白浓度等量的Fe2+,并利用透析实验和金属离子孵育的方法进一步确认了PDO需要Fe2+作为辅因子,一部分PDO中可以用Mn2+取代Fe2+,这与过硫化物双加氧酶属于MBL (metallo-β-lactamase)家族的特征相符合。根据序列相似性,利用BLASTP程序寻找了在革兰氏阳性细菌中的可能的硫加氧酶,将这3个可能的硫加氧酶基因与已知活性的CpSQR的基因连接在一起,并克隆至pBBR1MCS2质粒上,再转化入E. coli BL21 (DE3),分析了该菌株的活性,发现异源表达的菌株能够快速的代谢H2S,说明这些阳性菌中可能的硫双加氧酶具有氧化硫烷(由CpSQR代谢H2S产生)的能力,但无法确定其是否以GSSH作为底物。将PaPDO2在其野生菌株Pseudomonas aeruginosa PAO1敲除后发现突变株APaPDO2积累了更多的H2S,这说明PDO在细菌H2S的氧化中起到重要的生理功能。(2) 将Cupriavidus pinatubonensis JMP134中的2个酶, CpSQR和CpPD02克隆至大肠杆菌中,进行异源表达,研究它们代谢H2S的途径。由于CpSQR中包含2个结构域,HcaD和DUF442,其中根据已经报道的文献知道HcaD是一个硫醌氧化还原酶,而DUF442则是一个可能的硫转移酶。结果发现CpSQR代谢H2S的产物主要是二硫化物和三硫化物,这与真核生物中不同；另外,发现并证明了CpDUF442是一个具有硫转移酶功能的结构域,它在3个酶催化H2S的反应中起到的作用都与在真核生物中的硫转移酶不同,其中一个新功能是它促进SQR产物多硫化物和GSH的反应速度,这暗示着CpDUF442在促进硫烷转移速率上发挥了重要的作用；另外,CpDUF442还催化GSSH和SO32-的反应,这与真核生物中报道的一致。发现了多硫化物和GSH或亚硫酸盐可以自发反应,并通过光谱学方法计算了它们的自发反应速率,分别是8.4±0.7 μM min-1和6.3±0.5 pM min-1,当加入CpDUF442时,前者的反应速度增加为13.3±1.2)μM min-1,而后者则没有明显变化。生化实验和体内分析数据都表明,CpDUF442不能以硫代硫酸盐作为底物,这与人和酵母线粒体中硫转移酶能转移硫代硫酸盐和GSH反应生成GSSH和亚硫酸盐的结论不一致。本文还对异源表达菌株代谢H2S和多硫化物的途径进行了阐述,研究了它们的代谢产物,并利用代谢产物进行了流量平衡分析：CpSQR和CpPDO2代谢H2S的产物为亚硫酸盐和硫代硫酸盐的混合物,有少量的硫烷累积,从流量平衡分析来看,CpDUF442催化GSSH和SO32-的功能在该系统中的作用并不明显,硫转移酶在代谢H2S过程中所起的作用可能主要是促进硫烷硫的分配,例如多硫化物和GSH的反应。最后,根据流量平衡分析提出了H2S在大肠杆菌中氧化途径的模型。(3) 在Cupriavidus pinatubonensis JMP134中,利用已经测序的基因组数据,对其硫化合物代谢相关的基因进行了系统的分析,发现它具有多个和硫化合物氧化相关的系统,分别是SQR/PDO/ST系统,SOX系统,SO系统以及FCSD系统等,利用无痕敲除对这些系统的关键基因进行了单敲除或多敲除,并利用野生菌和敲除菌株的全细胞分析了代谢H2S,SO32-或S2032-的产物。分析结果发现,负责H2S氧化的主要是SQR/PDO/ST系统,SOX系统可能在SQR功能失活后起到互补的功能,也可能是互补SQR的功能,但是效率不高；在野生菌中SQR/PDO/ST系统代谢H2S时可检测到的产物只有S2O32-,这与利用大肠杆菌异源表达SQR/PDO/ST氧化H2S时的产物(S032-和S2032-的混合物)不同,分析与PDO的活性有关系,代谢产物是否具有SO32-仍需要进一步实验；负责外源的SO32-氧化的主要是SO系统,即SorAB,产物为硫酸盐,并且亚硫酸盐消耗和硫酸盐生成接近1：1,SOX系统(包括SoxCD)并不能起到氧化外源亚硫酸盐的作用；同样,负责内源和外源S2032-氧化的系统主要是SOX系统,氧化产物为硫酸盐,每分子硫代硫酸盐生成约2分子硫酸盐,SoxF(即FCSD)可能作为SOX的一个重要部分参与其氧化硫代硫酸盐和H2S,但是单独作用并没有氧化H2S的功能。亚硫酸盐和硫代硫酸盐的氧化途径均符合质量守恒定律,这样在细胞中不会过多地积累这一类硫化合物,均以硫酸盐的形式排放到环境中。根据基因组分析和全细胞分析的结果,还提出了在异养细菌C. pinatubonensis JMP134中的硫化合物的代谢模型,该模型包括了从硫酸盐的同化作用开始,到细胞内H2S的产生,以及H2S主要由SQR/PDO/ST系统氧化的过程,产物可能主要是SO32-,以及SO32-与SO32-在周质空间内依赖于SOX或SO系统的氧化情况等,还对于胞内的SO32-与SO32-之间的转化及其与硫烷库和硫转移酶的关系进行了初步讨论,该工作为将来可能应用带有SQR和PDO酶的异养细菌去除环境中H2S的生物修复打下理论基础。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q93
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本文编号：1268517