钙信号在小鼠卵母细胞减数分裂恢复中的作用机理

发布时间：2017-12-09 05:20

  本文关键词：钙信号在小鼠卵母细胞减数分裂恢复中的作用机理

  更多相关文章： 卵母细胞减数分裂 鞘氨醇激酶 鞘氨醇-1-磷酸 钙离子 NPR2亲和性

【摘要】：卵泡壁层颗粒细胞表达的NPPC与其表达在卵丘细胞中的受体NPR2结合,产生cGMP维持卵母细胞减数分裂的阻滞。LH通过促进颗粒细胞中EGF样生长因子的表达转激活卵丘细胞中的EGF受体诱导卵母细胞减数分裂恢复。前期的研究表明,LH依赖的EGF受体信号通路升高了卵丘细胞内钙离子水平使NPR2失活,导致cGMP水平下降,卵母细胞减数分裂恢复。本研究着眼于探究激活EGF受体升高卵丘细胞内钙离子水平的分子机制,以及卵丘细胞内高水平的钙离子使NPR2失活的分子机理。鞘氨醇-1-磷酸(S1P)动员内质网钙库使胞内钙离子水平升高。S1P由鞘氨醇激酶(SphK)磷酸化鞘氨醇(Sph)产生。SphK有SphK1及SphK2两个亚型。我们发现在体外培养的小鼠COCs中,添加 SphK的抑制剂SKI-Ⅱ抑制了 EGF诱导的卵母细胞减数分裂恢复与卵丘扩展。UPLC-HRMS技术检测发现体内注射hCG或体外添加EGF均能升高COCs中S1P水平,而SKI-Ⅱ则显著抑制了 EGF诱导的胞内S1P水平的升高,说明EGF激活SphK产生S1P。进一步研究表明,MAPK3/1的抑制剂U0126显著抑制了 EGF诱导S1P水平的升高,说明EGF可能通过MAPK3/1激活SphK。接下来我们发现,SKI-Ⅱ能够抑制EGF诱导的卵丘细胞内钙离子水平升高,并能显著逆转由EGF介导cGMP水平的降低,说明胞内钙离子水平升高降低了 NPR2活性。利用卵泡培养模型进行的研究表明,SKI-Ⅱ能够显著抑制LH诱导的卵丘细胞内钙离子水平升高、卵母细胞减数分裂恢复与卵丘扩展。接着我们利用SphK1-/-;SphK2f-;Cyp19-Cre小鼠研究敲除颗粒细胞中SphK1及SphK2对卵母细胞减数分裂恢复的影响。结果表明,注射hCG4小时后,SphK1-,-;SphK2f/-;Cyp19-Cre小鼠卵母细胞的GVBD率为53.7%±2.4%,低于对照组小鼠(96.3%±0.9%),且注射hCG 2小时后卵丘细胞内钙离子水平也并不上升。超数排卵实验表明,SphK1-/-;SphK2f/-;Cyp19-Cre小鼠每只的平均排卵数为29.3±1.2枚,而对照组小鼠每只平均排卵数为56.0±3.2枚。此外,我们统计了 5个月内小鼠的繁殖情况,发现SphK1-/-;SphK2f-;Cyp19-Cre小鼠平均每只在5个月内共产崽17.8土1.9只,显著低于对照组小鼠(43.0±6.9只)。下面我们研究了卵丘细胞内高水平的钙离子使NPR2失活的分子机制。在小鼠卵泡中,LH通过激活EGF受体来升高卵丘细胞内钙离子水平,但降低了 NPR2与NPPC的亲和性。在体外培养的COCs中,EGF激活EGF受体升高卵丘细胞内钙离子水平升高,降低了 NPR2与NPPC的亲和性及cGMP水平。然而LH或EGF均不改变卵丘细胞中NPR2的蛋白水平。此外,添加SKI-Ⅱ逆转了由LH或EGF介导的卵丘细胞内NPR2与NPPC亲和性下降。这些结果表明LH-EGF受体信号通路升高卵丘细胞内钙离子水平下降了 NPR2与NPPC的亲和性,导致NPR2失活,卵母细胞恢复减数分裂。我们还发现,镁离子与钙离子作用相反,在维持NPR2功能方面起着重要作用。综上所述,LH-EGF受体信号通路通过激活MAPK3/1导致SphK的激活,产生S1P升高卵丘细胞内钙离子水平,使NPR2与NPPC亲和性下降,cGMP水平下降,卵母细胞减数分裂恢复。以上结果从分子水平上阐明了钙离子在卵母细胞减数分裂恢复中的重要作用,进一步完善了与卵母细胞减数分裂恢复相关的分子机理,同时对临床研究及应用也有一定借鉴意义。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q492

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本文编号：1269226