小鼠早期胚胎线粒体DNA重头甲基化的研究

发布时间：2017-12-09 07:39

  本文关键词：小鼠早期胚胎线粒体DNA重头甲基化的研究

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【摘要】：作为细胞内数量最多的细胞器,线粒体不仅是细胞能量合成的重要场所,同时还参与细胞内离子平衡、氨基酸代谢、脂肪酸代谢、凋亡调控等诸多生物学过程。线粒体功能和动态的维持与调控需要众多线粒体基因(Mitochondrial genes, MtGs)的参与。除了线粒体]DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)自身编码的37各基因外,大多数(约1200个)都是由核基因组编码然后进入线粒体或与线粒体结合发挥作用。在早期胚胎发育过程中,从附植前的囊胚(E3.5)到附植后胚胎(E7.5、E10.5),线粒体会经历剧烈的功能和动态变化,这些变化对于早期胚胎的存活和生长发育至关重要。在此期间,早期胚胎经历了另一个重要的生物学事件,即DNA的重头甲基化过程,该过程是体细胞核基因组建立DNA甲基化模式的生物学基础。线粒体动态变化的窗口期与DNA重头甲基化的窗口期时间上高度重合。本研究利用高通量的甲基化测序手段,即MeDIP-seq,发现大多数核编码线粒体基因启动子区的甲基化模式,完全服从整个核基因组的重头甲基化过程,提示该过程对核编码线粒体基因具有重要的调控作用。值得注意的是,特异性的针对mtDNA基因组甲基化水平的分析,发现早期发育过程中,线粒体mtDNA局部会发生甲基化显著升高的现象。据此,我们推测,mtDNA在早期胚胎发育过程中会发生与核基因组类似的DNA重头甲基化现象。进一步,利用更加精确的MeDIP-qPCR技术,证实了从附植前囊胚到附植后胚胎,mtDNA整体发生了重头甲基化现象,并且这一过程不依赖于mtDNA区段类型和CpG密度。接下来,对引起mtDNA重头甲基化的机制进行了探索,利用免疫电镜、Western blotting、ChIP-qPCR技术证实了对核基因组重头甲基化具有关键作用的甲基转移酶(DNA methyltransferases 3A, DNMT3A) 和 DNMT3B,在围植期可以进入线粒体并且与mtDNA发生特异性的结合。在上述基础上,利用MitoProtⅡ软件预测了DNMT3A和DNMT3B具有线粒体靶向序列(Mitochondria-targeting sequence, MTS),并在细胞水平对其功能进行了验证,证实了DNMT3A和DNMT3B具备进入线粒体的结构基础。此外,利用商业化的MTS在293T细胞中进行了靶向线粒体的DNMT3A过表达,可以显著升高293T细胞mtDNA甲基化水平。上述结果首次回答了mtDNA甲基化修饰从何而来的科学问题,并且通过功能性实验证实了DNMT3A和DNMT3B在早期发育过程中可以进入线粒体,完成mtDNA的重头甲基化过程。此外,基于线粒体在早期胚胎发育中的重要作用,利用E3.5、E7.5和E10.5三个重要发育阶段的体内胚胎(in vivo, IVO)和体外受精(in vitro fertilized, IVF)胚胎的转录组数据,过滤出约1200个核编码及mtDNA编码的线粒体基因,进行功能学分析。结果显示：(1)IVF胚胎围植期的线粒体合成受到了抑制,并且mtDNA甲基化维持出现异常；(2)IVF胚胎的谷胱甘肽(GSH)合成以及GSH在线粒体中的抗氧化功能都受到持续的抑制,增加了IVF胚胎的凋亡；(3)IVF胚胎线粒体的β-氧化、氧化磷酸化和氨基酸代谢过程均出现持续的异常；(4)IVF胚胎的线粒体跨膜转运和膜结构的组织异常。这些结果提示,线粒体功能的紊乱可能是导致IVF胚胎发育异常的重要因素。据此,我们通过在体外培养阶段添加对线粒体功能具有促进和修复作用的抗氧化分子褪黑素(melatonin),使IVF胚胎的线粒体功能得到显著恢复,进而缓解了IVF胚胎的发育异常。这为IVF发育异常的机制研究和技术改进提供了新的思路：细胞器损伤是影响IVF胚胎发育的关键,而针对特定细胞器的靶向性修复是改善IVF发育的有效途径。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q954.4

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本文编号：1269587