重组凝血因子VII在CHO细胞中的高效表达

发布时间：2017-12-10 02:12

  本文关键词：重组凝血因子VII在CHO细胞中的高效表达

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【摘要】：作为凝血途径中重要的凝血因子,活化的凝血因子VII(coagulation factor VII,FVII)可以有效克服使用VIII因子治疗甲型血友病出血时导致病人产生抗体的缺陷,是目前临床治疗甲型和乙型血友病的最常用药物,活化的FVII还可用于治疗临床创伤性出血,尤其是高龄产妇分娩出血的治疗,我国每年需进口全球唯一重组FVII(recombinant factor VII,r FVII)生产厂商诺和诺德公司(Novo Nordisk)的产品诺其(Novo Seven?)约9亿元人民币。2013年受国家重大新药创制专项委员会指令性“三重”计划委托,实验室团队与苏州大学共同承担了r FVII仿制药物的研发(重组人凝血因子的研制及临床前试验2013ZX09102033),负责r FVII药物前体的生物制备工作。按照美国食品药品监督管理局(food and drug administration,FDA)和中国FDA(China food and drug administration,CFDA)重组蛋白注射液原料药生物制备的指导原则,本研究利用中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)构建了r FVII的表达细胞并悬浮驯化形成工程细胞,用于药物前体r FVII的表达和生产。通过流加悬浮培养方式提高其表达量,建立了适用于r FVII的高密度培养方法。主要结果如下:1.通过电转效率和信号肽的优化进行r FVII高表达CHO细胞的构建。针对电转效率的检测分析方法,利用FVII一抗和带有荧光染料的二抗对电转中阳性细胞进行标记,进而通过流式细胞仪对电转效率进行精确定量检测,同时对对电转条件进行了优化。优化后条件为电压400 V、质粒20μg、电击三次,并添加鲑鱼精子DNA作为携体DNA,转染效率可达到85%。利用FDA和CFDA认可的CHO细胞作为表达宿主,结合富含GC的高效表达p MH3质粒,构建了带有不同信号肽(Ori,Ig K,Ht,Gl,Mutant)的r FVII表达质粒。将带有不同信号肽的r FVII表达质粒电转转入CHO细胞后,考察不同信号肽对r FVII表达的影响,悬浮培养中带有信号肽Ig K的表达细胞具有最高的r FVII表达量,达到5.42 mg?L-1,表达量和转录水平均高于FVII自身信号肽Ori。2.通过流式细胞仪建立高表达克隆高效筛选技术。针对传统克隆挑选方法耗时较长和依赖于人工经验的缺点,本文基于流式细胞仪将Ig K表达质粒电转后的细胞分选至96孔板,在考察每孔细胞分选数条件后,确定以每孔3个细胞的条件进行分选并进行克隆筛选,经过两次点杂交和WB检测后得到一株r FVII高表达CHO细胞。与传统筛选方法下获得的细胞相比,两株细胞在细胞生长和r FVII表达方面并无明显差异,同时确定了r FVII阳性表达细胞纯度约为100%。利用建立的高表达克隆的快速筛选方法,使克隆挑选时间由传统方法的8个月缩短为目前的两个月,有效提高了高表达克隆的筛选效率。3.通过高密度培养条件的考察和优化提高r FVII在悬浮培养中的表达量。通过考察接种密度和培养温度,发现在1.0×106个?m L-1和34℃条件下有利于r FVII的表达,表达量分别达到7.49 mg?L-1和7.18 mg?L-1,而37℃更有利于细胞生长,因此确定阶段培养策略,即以1.0×106个?m L-1接种密度、37℃培养3天,之后降温至34℃并流加补料培养基。在比较了不同商业SFM后,发现B001+F001的SFM在3 L摇瓶反应器中,采用两阶段培养策略培养后r FVII表达量达到24.51 mg?L-1。在分析流加培养过程中CHO细胞周期的变化后,发现第3天补充添加F001后使G1/G0期细胞比例提高到80%以上,较高的G1/G0期细胞比例无法被亚油酸和丁酸钠进一步提高。在5 L生物反应器中进行流加补料培养中,细胞密度在第2天至第8天维持在较高水平,培养结束后在第9天r FVII达到46.3 mg?L-1。4.基于免疫亲和层析柱的r FVII高效纯化。CHO/r FVII的表达培养基首先经过Q阴离子交换柱纯化以达到富集的目的,洗脱后r FVII蛋白的得率仅为47.31%,由于较低的蛋白得率没有达到富集的目的,因此后续纯化中由免疫亲和层析柱一步法完成。制备免疫亲和层析柱中采用了苏州大学合作团队提供的3G3、9E8、9F11和10E5四种抗体,在考察了四种抗体制备的亲和柱对r FVII纯化的效果后发现,3G3抗体制备的亲和柱纯化得率和纯度最高,分别为92.3%和91.48%。之后考察了不同p H值和Na Cl浓度对r FVII纯化的影响,发现p H 3.5条件下r FVII纯化后得率和纯度分别为89.47%和90.31%,而Na Cl溶液不能对r FVII进行有效洗脱。在考察不同r FVII浓度对纯化影响时发现,培养基稀释5倍后会略微降低r FVII蛋白的得率,浓缩5倍后并不影响r FVII的得率和纯度。最终纯化策略确定培养基浓缩5倍后,经过3G3免疫亲和层析柱纯化蛋白并在p H 3.5条件下洗脱,纯化后r FVII得率为89.6%,纯度为92.58%。纯化后得到的药物前体r FVII经苏州大学合作团队活化表明具有生物活性。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78;R554.1

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本文编号：1272731