中间丝蛋白Nestin调节细胞内环境稳态的作用机理研究

发布时间：2017-12-10 18:38

  本文关键词：中间丝蛋白Nestin调节细胞内环境稳态的作用机理研究

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【摘要】：细胞骨架是真核生物细胞中重要的蛋白纤维网架系统,是细胞内除了生物膜体系以及遗传信息表达体系外的又一大非常重要的结构体系,其主要包括三大类:微管、微丝、中间丝。它们不仅参与维持细胞的形态、保持细胞内部结构的有序性,还与细胞内的物质运输、分裂与分化、信号传导与基因表达以及细胞运动等重要生命活动密切相关。在这三类骨架中,尤其以中间丝蛋白家族最为特殊,主要表现为:1.构成微丝和微管的基本成分分别局限于肌动蛋白和微管蛋白,而中间丝则可以由一个或多个不同的亚单位形成;2.中间丝蛋白是最稳定的细胞骨架,也是三类骨架纤维结构中化学成分最为复杂的;3.微管和微丝作为细胞中重要的管家蛋白,对于细胞整个生命过程的结构和功能的维持至关重要,相反,中间丝的表达则具有位置和时间的特异性。正因为如此,多数学者认为中间丝蛋白的生物学功能远超出目前对于骨架蛋白功能的理解,而对其结构和功能的深入探究将为我们解析不同来源以及不同阶段的组织细胞生物学特征提供重要依据。在脊椎动物中,中间丝蛋白家族根据其基因结构和表达模式的不同被分为六大类,如:酸性角蛋白(I)、碱性角蛋白(II)、波形蛋白和结蛋白(III)、神经丝(IV)、核纤层蛋白(V)、巢蛋白(Nestin)(VI)等。虽然中间丝蛋白种类具有多样性,但是其结构却有一定的共同点:1.所有的中间丝蛋白质都由头部、杆状区和尾部三个部分组成;2.其蛋白序列中间都有一段由310个氨基酸组成保守的以α-螺旋排列的超螺旋杆状区;3.蛋白序列的n端(头部)和c端(尾部)都是非螺旋结构,在大小的氨基酸组成上有很大差异。已有研究表明,中间丝蛋白家族的不同结构域与该蛋白的功能特点密切相关。例如:核纤层蛋lamins的n端和c端参与了其蛋白组装过程,而中间杆状区与c端则通过其中的入核序列(nls),指导lamins入核发挥功能;另一方面,角蛋白18(k18)能够通过其n段结合14-3-3蛋白来调控肝细胞的有丝分裂进程,且ser33位点的磷酸化对于该结合过程至关重要。nestin作为第vi类中间丝蛋白,c端较长,n端较短,其蛋白结构的特殊性决定了nestin不能进行自身组装,必须与其它的中间丝蛋白(vimentin,α-internexin等)组装成异源二聚体。小鼠nestin基因由4个外显子和3个内含子所组成,具有三个转录起始位点。其中,第1个内含子有肌肉细胞特异性的增强子活性,第2个内含子则调控中枢神经系统神经前细胞表达。近年来多项研究显示,nestin基因的转录可被多种转录因子激活,如sp1和sp3。在胚胎发育时期,nestin最早表达在具有多向分化潜能的神经上皮干细胞中,随着细胞不断分化,其表达呈下调趋势,并在分化完成后消失。除此之外,在胚胎发育早期新生血管过程中,nestin也被检测到在内皮细胞中表达,其表达也会随着血管的成熟而不断下调。而在成体组织内,中间丝蛋白nestin仅在未完全分化、保持一定增殖能力的成体干/祖细胞群体中表达。因此,这类nestin+细胞是成体干细胞池重要的组成部分,在维持机体干细胞池稳态中发挥重要作用。近期,mendez-ferrer等人利用nestin-gfp转基因小鼠首次证实了骨髓中存在一群nestin+细胞,并可在体外成克隆生长,具备成骨、成脂、成软骨方向分化特性,提示中间丝蛋白nestin是骨髓间质干细胞(mscs)的重要候选标志。随后,该研究小组进一步证明,nestin+细胞可以分为nestin强阳性(nestinbright+)与nestin弱阳性(nestindim+)两个细胞亚群,其中nestinbright+细胞参与维持小动脉周围的造血干细胞的静息状态;而nestindim+细胞则与髓窦处的造血干细胞的增殖、分化密切相关。这提示nestin不仅可以是骨髓原位mscs的重要标志,还可能参与骨髓造血微环境的稳定维持。那么,nestin能否成为其他组织来源的mscs的共同标志呢?本课题组前期利用nestin-gfp转基因小鼠研究发现,从骨髓、睾丸、肾脏等多种组织中分离获取的nestin+细胞,具有自我更新和多向分化的能力,证明了中间丝蛋白nestin是成体组织中间质干细胞的特异标志,为进一步获得适合损伤修复的间质干细胞亚群提供了重要依据。另一方面,本实验室在国际上首次构建了nestin基因敲除小鼠模型,发现nestin基因缺失可以引起神经干细胞自我更新能力下降,细胞死亡显著增加;同时,nestin基因敲除后纯合子小鼠在胚胎发育10.5天-11.5天死亡,其主要原因是胚胎卵黄囊的血管发育迟滞,血管周具有mscs特性的细胞死亡增加。此结果同样表明中间丝蛋白nestin可能参与了机体mscs的自我更新与维持。因此,nestin不仅仅可以作为成体组织间质干细胞的标志物,还可能作为一种重要的功能蛋白参与组织干细胞池的稳定和维持。除了正常状况以外,中间丝蛋白nestin还可以在异常的组织细胞中表达,包括一些损伤或者病变的组织。例如,脊髓损伤后的神经胶质细胞及室管膜细胞,视网膜中神经损伤后的星形胶质细胞等,中间丝蛋白nestin可以在损伤部位再次表达,提示nestin可能参与了组织修复过程。此外,nestin也被发现在肝脏星形细胞中表达,在肝脏发生纤维化的过程中,星形细胞大量增殖、激活,nestin+细胞数量也随之升高。该结果同样提示,nestin可能参与到肝纤维化进程中。近年研究发现,多种肿瘤组织可以检测到中间丝蛋白nestin的表达,如脑胶质瘤、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、肺癌和胰腺癌等,且nestin的表达与肿瘤增殖、转移等呈正相关。因此,中间丝蛋白nestin也被认为是多种肿瘤干细胞的标志物。课题组前期以非小细胞肺癌细胞株为模型探讨nestin在非小细胞肺癌中的作用及机制,发现nestin在非小细胞肺癌中的表达与患者预后有关,在多个肺癌细胞株下调nestin表达可导致细胞增殖减慢,细胞周期停滞于s期,磷酸化rb蛋白、磷酸化akt和磷酸化gsk3α/β表达减少,提示nestin通过akt-gsk3β-rb信号通路调控非小细胞肺癌细胞增殖。综上所述,进一步深入阐明中间丝蛋白nestin在不同类型细胞中的作用机制,有助于揭示其在维持细胞内环境稳态中的重要作用。现有研究显示,中间丝蛋白作为细胞骨架的重要成分,其主要功能可能是作为细胞内高度特异化的应激蛋白,在多种应激环境下发挥保护细胞稳态的功能:1.凋亡压力(apoptoticstress):细胞凋亡是机体维持自身稳定的一种基本生理机制,处于极端环境中的细胞可通过这种自我牺牲的方式,来维持所在组织和器官的稳态平衡。不同的细胞内的多种中间丝蛋白都能够发挥抗凋亡的作用,例如,角蛋白8和角蛋白18分别通过与肿瘤死亡因子受体2(tnfr2)和tnfr相关死亡结构域(tradd)相结合、提高细胞外fasl受体的数量等多种方式发挥其抗凋亡功能;此外,小鼠心肌细胞敲除结蛋白(desmin)后可诱导其发生凋亡,同时可以通过过表达抗凋亡蛋白(如:bcl-2)来缓解。2.氧化应激(oxidantstress):活性氧(reactiveoxygenspecies,ros)是由机体内部的代谢或外部的刺激所产生的一类比分子氧(o2)的化学活性更活跃的含氧自由基。在细胞中,ros主要由线粒体以及nox蛋白家族产生,参与维持机体正常的生理功能。但是,当机体发生异常时,过量积累的ros则会引起细胞内的氧化应激反应,甚至损伤组织细胞。此时,细胞就需要通过多种抗氧化物质来维持其内环境稳态,而在这一过程中,中间丝蛋白可能发挥着抗氧化应激的重要作用。malhas等人把小鼠成纤维细胞内的laminb1敲除后发现,细胞内的ros水平上升,并且对h2o2处理的敏感性增加,同时,敲除大鼠神经元前体细胞内的中间丝蛋白nestin也会使h2o2诱导的细胞凋亡大大增加,但是其中的具体机制仍未阐明。3.代谢压力(metabolicstress):研究表明,多种中间丝蛋白可参与调控细胞的代谢过程,进而发挥其重要的生物学功能。而与细胞代谢关系密切的多种细胞器中,最重要的就是线粒体。据报道,tao等人发现,敲除了角蛋白8的小鼠肝细胞内的线粒体明显缩小,代谢功能发生改变。但是,中间丝是如何靶向细胞器的?其中的分子机制是什么?nestin作为重要的第vi类中间丝蛋白,是否也参与了细胞器形态和功能的调节?同时,中间丝蛋白nestin调节ros,维持细胞内环境稳态的具体机制是什么?这些问题都还有待进一步研究。本实验室长期从事nestin蛋白功能的研究,前期研究表明中间丝蛋白nestin对于胚胎的发育至关重要,敲除nestin后纯合子小鼠在胚胎发育早期死亡。与此一致的是,nestinko的胚胎干细胞(es)在体外分化形成胚体(eb)的过程中大量死亡。接着,我们通过加入多种程序性死亡抑制剂:z-vad-fmk(泛caspase凋亡抑制剂)、3-methyladenine(程序性自噬抑制剂)、nec1(程序性坏死抑制剂)后发现,加入凋亡、程序性自噬的抑制剂并不能抑制nestinko小鼠eb细胞的死亡,而加入程序性坏死抑制剂后却可以缓解这一现象。另一方面,程序性坏死的主要机制为rip1/rip3复合物促进细胞内整体能量代谢水平,线粒体源性的ros水平升高,破坏细胞稳态,最终导致细胞坏死。提示nestinko的es分化过程中eb细胞的程序性坏死主要是细胞内ros升高所导致。进一步,通过加入ros抑制剂(nac等)发现,nestinko导致的细胞死亡确实可以通过降低胞内ros来缓解,但对于中间丝蛋白nestin如何影响细胞ros水平,进而调控细胞内环境稳态的具体分子机制尚不明朗。另外,通过coip结合质谱分析和超分辨显微镜等方法,观察到中间丝蛋白nestin可以与细胞中多种功能蛋白相互结合,如热休克蛋白家族(hspfamily),内质网钙atp酶(serca2),核纤层蛋白(lamina/c)等,有趣的是,通过进一步生物信息学分析发现,这些蛋白多数定位于细胞内膜系统上,提示中间丝蛋白nestin可能参与维持细胞内膜系统的稳定。既然中间丝蛋白nestin可以与serca2,lamina/c等多种功能蛋白相互结合,那么中间丝蛋白nestin靶向内膜系统的过程是否有以上功能蛋白的参与?他们之间的相互作用是否与内膜系统的稳态维持有关?同时,nestin调节细胞内ros的水平的分子机制尚不清楚,是通过从源头减少ros的生成,例如调节线粒体代谢功能,还是通过提高细胞内ros的清除速度,如调节细胞内的抗氧化体系来降低ros的水平呢?这些重要的科学问题还有待进一步研究,但都提示了中间丝蛋白nestin与细胞内环境稳态密切相关。因此,拟在前期工作基础上,进一步探究中间丝蛋白nestin调节细胞内环境稳态的作用机理,本论文研究内容包括:第一部分:nestin参与细胞内膜系统的稳定维持第二部分:nestin通过影响线粒体动力学调控细胞内环境活性氧产生的分子机制第三部分:nestin通过保护nrf2蛋白稳定性调控细胞内环境抗氧化的分子机制第一部分nestin参与细胞内膜系统的稳定维持1.1目的本实验室前期利用coip-质谱结合技术和超分辨显微镜技术得到多种可能与中间丝蛋白nestin相互作用的蛋白成分,进一步分析提示中间丝蛋白nestin可能与多种膜性细胞器存在相互作用。因此,本部分研究拟对nestin的生物学功能及其对细胞内膜系统的形态功能的影响进行概括性初步探究。1.2方法1.2.1检测nestin与线粒体的关系。在神经干细胞nsc中,将nestin和coxiv免疫荧光染色,共聚焦显微镜下观察,进行共定位分析;分离线粒体部分提取蛋白质,通过westernblot检测nestin蛋白的含量;构建nsc的nestin干扰株,检测干扰前后nsc的线粒体代谢功能。1.2.2检测nestin对神经干细胞nsc增殖分化的影响。利用nsc的nestin干扰株,通过nestin与ki67免疫荧光染色,统计增殖细胞所占比例;通过成球培养,检测nsc的成球效率;不定向诱导nsc分化,tuj-1和gfap免疫荧光染色,统计nsc分化方向。1.2.3利用小鼠神经干细胞系c17.2进行serca2与nestin免疫荧光染色,以及coip实验,验证serca2与nestin蛋白间的关系。1.2.4检测nestin与内质网的关系。利用nsc的nestin干扰株,利用er-tracker染色检测细胞内质网形态改变,并且利用q-pcr检测erstress水平。1.2.5检测nestin与细胞核的关系。构建肺癌细胞系a549和h1299的nestin干扰株,利用dapi对细胞核进行荧光染色,共聚焦显微镜下观察,利用软件分析细胞核圆度,并利用q-pcr,westernblot和免疫荧光染色检测lamina/c和laminb的表达。1.2.6验证nestin与lamina/c蛋白间的关系。通过免疫荧光染色,核蛋白提取进行westernblot,检测nestin蛋白在细胞核是否有分布;通过coip实验,验证nestin与lamina/c是否存在相互结合。1.3结果1.3.1.nestin可以与线粒体相互结合,干扰nestin会导致细胞内线粒体代谢功能改变。1.3.2干扰nestin引起神经干细胞增殖能力减弱,分化能力增强。1.3.3.nestin可以与内质网膜上serca2蛋白相互结合。1.3.4干扰nestin导致内质网形态改变,nestin表达下降过程中erstress水平升高。1.3.5干扰nestin导致细胞核畸形率增高,细胞核膜结构松散。1.3.6.nestin可以入核与核骨架中lamina/c相互结合。1.4结论1.4.1.nestin可以与线粒体结合并影响线粒体的代谢功能,进而调控神经干细胞的增殖及分化能力。1.4.2.nestin可以与内质网钙泵serca2结合并影响内质网的形态和功能。1.4.3.nestin可以入核并与核纤层蛋白lamina/c结合进而影响核膜结构的稳定性。第二部分nestin通过影响线粒体动力学调控细胞内环境活性氧产生的分子机制2.1目的前期的研究表明,中间丝蛋白Nestin可以与线粒体结合并影响线粒体的代谢功能。因此,本项目研究拟通过构建稳定干扰Nestin的肿瘤细胞系GIST-T1和GIST-882,深入探讨Nestin影响线粒体的形态功能以及肿瘤细胞的生物学行为的具体作用机理。2.2方法2.2.1检测干扰Nestin对细胞ROS的影响。构建胃肠间质瘤(GIST)细胞系GIST-T1和GIST-882的Nestin干扰株,检测细胞内总ROS,Nox蛋白家族产生的ROS以及线粒体来源的ROS的变化。2.2.2利用Mito-Tracker试剂对GIST细胞系线粒体进行染色,通过共聚焦显微镜观察,对比sh Nestin组与对照组线粒体的形态改变。2.2.3利用Q-PCR、Western blot、Co IP、免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察分析,从多个角度来检测Nestin、线粒体动力学相关蛋白、线粒体三者的关系。2.2.4检测Nestin、Drp1与肿瘤增殖、迁移能力的关系。构建可诱导干扰Nestin细胞系以及Drp1过表达GIST细胞系,通过体外实验(划痕实验、transwell迁移实验)和小鼠体内荷瘤实验分别检测Nestin、Drp1是否与肿瘤增殖、迁移能力有关。2.2.5利用病人胃肠间质瘤标本,通过Western blot、IHC实验验证Nestin表达量与肿瘤增殖、迁移能力的关系。2.3结果2.3.1干扰Nestin导致细胞内总ROS水平下降,更进一步的检测提示,主要是由于线粒体来源的ROS水平下降。2.3.2干扰Nestin导致线粒体形态由点状变为管状。2.3.3.Nestin与线粒体分裂蛋白Drp1相互结合,干扰Nestin导致细胞内线粒体上的Drp1蛋白减少,从而导致了线粒体形态的改变。2.3.4干扰Nestin导致肿瘤细胞体外增殖、迁移能力下降,体内成瘤性下降。2.3.5病人胃肠间质瘤标本中,Nestin表达量与肿瘤增殖、迁移能力呈正相关。2.4结论2.4.1中间丝Nestin参与调节细胞内环境活性氧,在肿瘤细胞GIST中干扰Nestin后导致细胞内总活性氧和线粒体来源的ROS下降。2.4.2干扰Nestin可导致细胞内线粒体形态由点状向管状变化。2.4.3中间丝蛋白Nestin与线粒体分裂蛋白Drp1在细胞内相互结合,干扰Nestin会导致细胞内定位于线粒体上的Drp1减少,Nestin通过招募Drp1定位于线粒体上从而调控线粒体动力学。2.4.4中间丝蛋白Nestin与胃肠道间质瘤细胞的生物学行为密切相关,体内和体外干扰Nestin都会引起肿瘤细胞增殖、迁移等能力下降。第三部分Nestin通过保护Nrf2蛋白稳定性调控细胞内环境抗氧化的分子机制3.1目的有文献报道,干扰Nestin能加快H2O2诱导的神经干细胞凋亡,过表达Nestin对H2O2诱导的细胞凋亡具有保护作用,提示干扰Nestin后神经干细胞抗氧化能力减弱。这意味着中间丝蛋白Nestin可能直接调控了细胞的抗氧化能力。因此,本项目研究拟通过构建稳定干扰Nestin的肿瘤细胞系A549和H1299,深入探讨中间丝蛋白Nestin调节细胞内环境抗氧化体系的具体分子机制。3.2方法3.2.1检测Nestin与细胞对氧化应激敏感性的关系。构建肺癌细胞系A549和H1299的Nestin干扰株,利用H2O2处理,然后进行Annexin V/PI染色和死活试剂盒染色分析,对比sh Nestin组与对照组的细胞存活率和死亡率。3.2.2利用Q-PCR、GSH含量检测试剂盒、SOD活性检测试剂盒,以及Nrf2和Nestin免疫荧光染色后共聚焦显微镜观察分析,检测干扰Nestin后,肺癌细胞系抗氧化体系的变化。3.2.3添加蛋白合成抑制剂(CHX)和蛋白降解抑制剂(MG132)处理细胞,利用Western blot、Co IP实验,验证Nestin与Nrf-2蛋白间的关系。3.2.4利用Co IP和免疫荧光染色实验,验证Nestin、Nrf-2和Keap1蛋白间的关系。3.3结果3.3.1通过Annexin V/PI染色流式分析和死活试剂盒染色后共聚焦显微镜观察分析发现,干扰Nestin导致肿瘤细胞对氧化应激的敏感性增加,细胞死亡增多。3.3.2对细胞抗氧化体系的检测结果提示,干扰Nestin导致肿瘤细胞抗氧化能力下降,并且Nrf2降解增多。3.3.3无论在正常状态或是氧化应激态下,干扰Nestin可导致肿瘤细胞Nrf2蛋白量减少,主要通过泛素-蛋白酶体降解途径。3.3.4.Nestin可竞争性结合Keap1来降低Nrf2降解水平。3.4结论3.4.1.Nestin与肿瘤细胞内抗氧化能力直接相关,干扰Nestin会导致肿瘤细胞对氧化应激敏感性增加,死亡增多。3.4.2干扰Nestin导致肿瘤细胞抗氧化能力下降,且Nrf2降解增多,表明Nestin可通过Nrf2来调控肿瘤细胞的抗氧化能力。3.4.3干扰Nestin可使肿瘤细胞内Nrf2的泛素化水平升高,促进肿瘤细胞内Nrf2通过泛素-蛋白酶体途径的降解。3.4.4.Nestin可通过竞争性结合Keap1从而抑制Keap1对Nrf2结合以及进一步的泛素化降解,从而稳定Nrf2的蛋白水平,上调细胞的抗氧化体系。
【学位授予单位】：中山大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R329.2
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本文编号：1275514