大肠杆菌转录因子和基因组多位点进化提高生产性能的研究

发布时间：2017-12-11 02:00

  本文关键词：大肠杆菌转录因子和基因组多位点进化提高生产性能的研究

  更多相关文章： 全局转录因子定向进化 基因组多位点同时进化 易错PCR 单链DNA 番茄红素 蛋白质进化

【摘要】：大肠杆菌具有遗传背景清楚、生长迅速和培养简单等特点,是工业生物技术领域最常用的宿主菌之一。本论文开展全局转录因子定向进化技术和基因组多位点同时进化技术的研究,以实现对大肠杆菌基因组上多个基因转录强度或多个基因位点的同时操控,为菌种改良提供了新的思路。本文首先通过进化大肠杆菌全局转录因子,从而直接或间接的调控菌体在全基因组规模上的转录水平,实现大肠杆菌菌种的改良。首先进化大肠杆菌全局转录因子CRP提高大肠杆菌中番茄红素的合成能力。在10L罐上的发酵实验中,含有A26T(D8V)的CRP突变子的大肠杆菌番茄红素产量较对照菌株提高了25%。为阐明突变CRP提高大肠杆菌合成番茄红素能力的机理,利用基因芯片技术测定突变菌株的全基因转录变化情况,和对照菌株比较发现突变菌株中有396个基因发生了差异表达,找到了可能影响菌体性状和目标代谢产物合成能力的关键基因群。为了探索大肠杆菌中其它全局转录因子的作用,通过进化另一个大肠杆菌全局转录因子FNR,将大肠杆菌对乙醇和丁醇的耐受能力分别提高了30%和28%,验证了通过转录因子定向进化实现菌株体内多个基因转录强度同时操控以改良菌株的可行性。本文接着从分析基因组多位点同时进化技术的机理和操作入手,搭建了一套自动化操作平台,填补了国内基因组自动化进化仪的研究空缺。该装置通过上位机软件程序自动控制多轴机械手和多个仪器部件的协同运作,完成了菌体培养、菌体收集、感受态细胞的制备、外源基因的添加和电转化等多个实验环节,实现了多轮同源重组的自动循环运行。该装置仅需4小时即可完成一轮同源重组,自动化连续运行直至大肠杆菌基因组突变文库构建完成。在此基础上,开展了寡核苷酸介导的蛋白质体内进化研究,以提高PQQGDH蛋白的热稳定性和底物特异性为目标,通过对大肠杆菌基因组上pqqgdh基因的两个三联密码子引入饱和突变,耦合颜色反应的高通量筛选,得到PQQGDH蛋白热稳定性和底物特异性同时提高的菌株,其在55℃下的半衰期提高了4倍,底物特异性提高了50%左右。为降低突变基因库的构建成本,尝试利用体外易错PCR制备双链DNA构建突变文库,对基因组上的dxs基因进行原位进化提高大肠杆菌番茄红素的合成能力。利用基于颜色的高通量筛选方法,获得番茄红素产量提高5倍以上的突变株,并通过基于HPLC的检测方法测定DXS突变体的酶活。结果显示DXS酶活提高是番茄红素产量增加的直接原因,表明了双链DNA介导的蛋白质体内进化策略的建立。为提高突变基因库的同源重组效率,开展了单链基因突变文库的制备研究。通过两步PCR法制备单链DNA突变库,将同源重组的效率提高到10%,是双链DNA重组效率的100倍。制备得到的单链DNA进一步以DNase I酶切,回收获得90 bp单链DNA作为突变文库,将同源重组的效率提高到15%。利用此策略进化基因组上的dxs基因,将大肠杆菌番茄红素的合成能力提高了50%,建立了一个具有普遍意义的大肠杆菌基因组多位点快速进化的策略。总之,本文致力于大肠杆菌体内多基因的同时操控以改良菌株性状,建立了全局转录因子定向进化和基因组多位点同时进化两种技术手段。本研究结果有望在获得具有工业应用价值的代谢工程菌株研究中发挥重要的作用。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78

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本文编号：1276698