SNAP-tag靶向蛋白质荧光标记与生物应用研究

发布时间：2017-12-11 22:26

  本文关键词：SNAP-tag靶向蛋白质荧光标记与生物应用研究

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【摘要】：蛋白质特异性标记技术在生物学研究中应用广泛,其中基于蛋白质标签特异性标记小分子的方法凭借标记的灵活性、特异性、稳定性和分子结构功能多样性等特点获得迅速发展,在活细胞内靶向蛋白质的实时动态研究中获得越来越多的关注。然而目前蛋白质标签方法的生物学应用领域仍有待拓展,构建蛋白质特异性标记体系并进一步利用新型荧光功能分子实现特异性标记对于相关研究具有重要意义。本文基于SNAP-tag蛋白标签技术设计构建了多个亚细胞蛋白质的靶向标记体系,利用特异性荧光分子实现蛋白质靶向的生物检测及蛋白质的动态变化分析。(1)实现了亚细胞蛋白特异性的一氧化氮荧光检测。利用探针TMR-NO-BG的苄基鸟嘌呤(BG)实现细胞核、线粒体靶向及细胞弥散表达SNAP-tag的特异性共价标记,利用邻苯二胺的罗丹明螺环(TMR-NO)实现NO的高灵敏(检测限67.3 nM)、高选择性响应。并成功实现巨噬细胞免疫应激和药物依托泊苷诱导细胞凋亡过程中蛋白质水平内源NO的检测。为NO的亚细胞功能研究提供可用的工具和方法。(2)实现了亚细胞定位蛋白微环境粘度的荧光检测。利用粘度响应荧光转子BDP-V BG实现蛋白靶向SNAP-tag的高特异性标记(53倍荧光增强),利用蛋白标记转子BDP-V-SNAP的双光子激发荧光寿命成像实现三种亚细胞定位(细胞弥散、细胞核和线粒体靶向)蛋白的微环境粘度检测(123-145 cP),并实现三种药物诱导细胞凋亡过程中H2B蛋白微环境粘度变化的检测。为蛋白质局部粘度检测和动力学研究提供策略。(3)实现了亚细胞定位蛋白的特异性双光子荧光成像。利用萘酰亚胺衍生物TNI-BG、QNI-BG和ONI-BG实现了体外纯化与细菌内SNAP-tag蛋白的特异性标记,真核细胞标记实验表明,双光子性能良好的ONI-BG(吸收截面128 GM)可实现多种亚细胞定位SNAP-tag蛋白标签的特异性标记与双光子成像。这一策略为双光子成像技术在蛋白质特异性标记中的应用提供方法。(4)构建了基于绿色荧光蛋白EGFP串联SNAP-tag蛋白脉冲标记染料TMR-BG的荧光比率成像体系。分别利用过氧化物酶体信号肽PTS1、自噬相关蛋白LC3B和组蛋白H2B构建EGFP-SNAP双标签体系,利用EGFP的绿色荧光为参比,对脉冲标记的TMR红色荧光进行比率成像。实现了过氧化物酶体周转代谢过程的比率成像分析和自噬形成过程动态变化的荧光分析,同时利用这一双标签体系的比率成像分析评价了不同条件下组蛋白H2B的周转代谢调控。
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q503;O657.3

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1 王超;SNAP-tag靶向蛋白质荧光标记与生物应用研究[D];大连理工大学;2017年

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本文编号：1280166