沙门氏菌噬菌体fmb-p1生物学特性与噬菌机制及其在冷藏食品中的应用研究

发布时间：2017-12-11 23:27

  本文关键词：沙门氏菌噬菌体fmb-p1生物学特性与噬菌机制及其在冷藏食品中的应用研究

  更多相关文章： 沙门氏菌 噬菌体 基因组 实时荧光定量PCR 吸附效率 脂多糖(LPS) 毒力岛 CRISPR/Cas

【摘要】：由沙门氏菌引起的食源性疾病在全球范围内造成了严重的损失,对人们的健康和食品安全产生了严重威胁。食品在加工、运输、销售的过程中极易被沙门氏菌污染,而且沙门氏菌在自然环境中抗逆性强,人或动物一旦接触了含有沙门氏菌的粪便、土壤、食品或水皆可引发沙门氏菌病。目前抗生素是治疗沙门氏菌病的主要物质。而抗生素的滥用及过量使用导致了耐药菌和多重耐药菌的大量出现,由其所引起的食源性疾病已成为当今世界上最广泛的公共卫生问题之一。因此,探索开发新的无副作用或副作用小的抗菌物质来取代或减少传统杀菌方法和技术显得非常重要。噬菌体作为细菌的天敌,鉴于其在控制各种病原菌特别是高耐药性超级细菌方面的显著效果,目前在全球范围内噬菌体的研究受到广泛关注。本研究筛选出抑菌谱广的沙门氏菌噬菌体,研究其生物特性、基因组学性质、吸附学特性、对宿主菌的作用机制和杀菌作用特点,并将其应用于冷藏食品及其生产加工过程,降低食品中沙门氏菌的污染。主要研究结果详述如下:1、沙门氏菌噬菌体的筛选与生物学特性研究以沙门氏菌为宿主菌,通过点斑法和双层平板法,从南京周边动物养殖场排水、河水和湖水样品中筛选获得沙门氏菌噬菌体12株。其中1株沙门氏菌噬菌体fmb-pl能够裂解S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. Anatum, S. Miami, S. Agona, S. Saintpaul and S.Paratyphi-C等7个血清型沙门氏菌。该噬菌体能在双层平板中形成2mm左右清晰的噬菌斑,潜伏期为20min,爆发量为77±4PFU/cell,裂解能力较强。透视电镜观察表明其具有不可收缩的长尾和多面体头部结构,是长尾科噬菌体(Siphoviridae)。沙门氏菌噬菌体fmb-p1环境适应能力强,能在40-70℃高温下、3%-11%盐浓度溶液、pH为5-9的溶液中保持活性,在-20、4和20℃条件下储存半年均可保持1010PFU/mL的高滴度。沙门氏菌噬菌体fmb-p1高滴度原液制备较为方便,液体富集增殖和固体增殖方法都能获得1010PFU/mL-1011PFU/mL的高滴度噬菌体悬液。2、沙门氏菌噬菌体fmb-p1鉴定与安全性评估验证研究采用de novo从头测序策略和基于Illumina二代测序的短序列的拼接软件SOAPdenovo /Velvet以及Hiseq2500测序系统完成了噬菌体fmb-p1的全基因组测序。结果表明,噬菌体fmb-p1全基因组为双链DNA,全长43327bp, GC平均含量为46.09%。该噬菌体基因组中含有60个ORF,占全长的80.15%,通过BLAST比对分析发现,其中25个基因为已知功能基因,另外35个基因编码假定蛋白。噬菌体fmb-p1是一株全新的噬菌体。噬菌体fmb-p1基因组和尾丝蛋白序列比对结果表明,fmb-p1与长尾科沙门氏菌噬菌体(Siphoviridae)有高度同源性,属同一科噬菌体。噬菌体基因组限制性核酸内切酶酶切和PCR结果表明,噬菌体fmb-p1不具有溶原性。基因组注释结果和毒性基因PCR验证结果表明,噬菌体fmb-p1是一株安全的噬菌体,具有作为生物杀菌剂的潜在应用价值。3、沙门氏菌噬菌体fmb-p1的吸附效率和吸附位点研究噬菌体吸附动力学结果表明,噬菌体fmb-p1的吸附速率极高,5min就可以达到90%以上,之后一直保持90%以上的吸附效率。在吸附过程中总有部分噬菌体没有被吸附,呈现游离状态。噬菌体fmb-p1的吸附过程符合吸附-解吸附-不可逆结合模型的理论预测结果。噬菌体fmb-p1的吸附效率测试结果表明,噬菌体的吸附效率受到宿主菌菌株、菌浓度等影响十分显著,而温度等理化因素影响较小。噬菌体fmb-p1对其宿主菌沙门氏菌的吸附效率高达8 0 %以上,对于非宿主沙门氏菌或其它非沙门氏菌的吸附效率非常低,低于30%。当宿主菌浓度在107CFU/mL以上时,噬菌体的吸附效率均在80%以上当宿主菌浓度低于107CFU/mL时,噬菌体的吸附效率迅速下降至30%左右。通过吸附干扰实验、电镜观察和基因测序及序列比对等手段,确定噬菌体fmb-p1的吸附受体为脂多糖。4、沙门氏菌噬菌体fmb-p1对沙门氏菌作用的分子机理研究通过实时荧光定量PCR技术,研究了噬菌体fmb-p1处理对沙门氏菌作用的分子机理。结果表明,除基因lpxA、msbA以外,噬菌体fmb-p1显著降低了沙门氏菌脂多糖合成基因的表达量,特别是与O抗原相关的基因,如rfc、rfbA和rfbC均可下调6 log2 fold以上。不同处理条件下,噬菌体处理显著降低了沙门氏菌的脂多糖合成基因表达量;但在生理盐水中和噬菌体处理沙门氏菌6h两种情况下,噬菌体处理使得沙门氏菌的脂多糖合成基因表达量出现上调,这可能与宿主菌的生理状态有关。研究了噬菌体fmb-p1对沙门氏菌相关毒性基因表达量的影响。结果发现,噬菌体fmb-p1显著降低了沙门氏菌4个毒力岛基因和毒性质粒的表达量。噬菌体fmb-p1对沙门氏菌噬菌体抗性基因表达量的影响结果发现,噬菌体fmb-p1处理沙门氏菌显著上调了沙门氏菌的噬菌体抗性基因 lexA、recA、CRISPR/Cas1、hsdS、hsdR、hsdM、mod 和 res 等的表达量。因此,沙门氏菌在抵御噬菌体侵袭时,同时启动了吸附抑制、降解外源核酸和应急救援等抗性机制。噬菌体fmb-p1对其抗性菌株关键基因表达量的研究结果表明,噬菌体fmb-p1显著降低了其宿主菌抗性菌株13个脂多糖合成基因的表达量。噬菌体fmb-p1显著降低了沙门氏菌4个毒力岛基因和毒性质粒的表达量。噬菌体fmb-p1处理沙门氏菌显著上调了沙门氏菌的噬菌体抗性相关基因lexA、recA、CRISPR/Cas1、hsdS、hsdR、hsdM、mod和res等的表达量。因此,这些结果进一步验证了噬菌体fmb-p 1对沙门氏菌的作用分子机制。5、沙门氏菌噬菌体fmb-p1在溶液体系中的杀菌作用研究研究了噬菌体fmb-p1在溶液体系中的杀菌作用。结果表明,噬菌体fmb-p1可降低鼠伤寒沙门氏菌2-5.5 log CFU/mL,降低肠炎沙门氏菌2.14-3.68 log CFU/mL,降低圣保罗沙门氏菌0.87-0.93 log CFU/mL。感染复数(MOI)对噬菌体的杀菌作用影响最显著,高MOI ( 105-106)条件下,噬菌体可降低沙门氏菌2-5 log CFU/mL甚至完全消除沙门氏菌的污染;低MOI (≤1 )条件下,噬菌体fmb-p1对沙门氏菌的防控效果较差,只能减少沙门氏菌1 log CFU/mL及以下。而pH、盐度对噬菌体fmb-p1的杀菌作用影响最小。温度对噬菌体作用的效果也有一定影响,在4℃噬菌体可以控制宿主菌数量在较低水平。噬菌体fmb-p1的杀菌动力学结果表明,噬菌体fmb-p1杀菌作用时间累积作用较弱,只有MOI达到一定数量级后(106),噬菌体的杀菌作用才显著。噬菌体fmb-p1对不同血清型沙门氏菌菌株杀灭作用存在显著差异,对鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌杀灭作用最好,对圣保罗沙门氏菌杀灭作用相对较差。噬菌体fmb-p1与防腐剂山梨酸钾、苯甲酸钠抑菌效果的比较结果表明,噬菌体fmb-p1可以杀死宿主沙门氏菌,显著降低其含量;而山梨酸钾和苯甲酸钠只能抑制沙门氏菌的增长,不能减少沙门氏菌数量。噬菌体fmb-p1能够减少沙门氏菌5 logCFU/mL以上,表明其具备作为能被监管部门认可的控制致病菌的新杀菌剂的潜力。6、沙门氏菌噬菌体fmb-p1在冷藏食品中的应用研究本研究发现噬菌体fmb-p1在冷藏食品具有较好的防控沙门氏菌效果,可以显著降低鸡肉、牛奶、鸭肉和冷鲜猪肉中的沙门氏菌含量。噬菌体fmb-p 1对鸡肉中沙门氏菌的杀菌结果表明,噬菌体可以显著降低鸡肉中沙门氏菌的含量约2-3 log CFU/g;在低温条件下,可使鸡肉中的沙门氏菌处于检测限以下。噬菌体fmb-p1对牛奶中沙门氏菌的杀菌结果表明,噬菌体可以显著降低牛奶中的沙门氏菌含量约1.7 log CFU/mL;在低温储存一个月的期间内,噬菌体使牛奶中的沙门氏菌一直处于检测限以下。噬菌体fmb-p1对鸭肉中沙门氏菌的杀菌结果表明,噬菌体可以显著降低鸭肉中的沙门氏菌含量约2.8-4.5 log CFU/g,而山梨酸钾只能减少沙门氏菌0.12-0.85 log CFU/g;噬菌体的浓度越高,杀菌效果越好;在低温条件下,噬菌体处理样品中沙门氏菌没有恢复生长现象出现,提高了鸭肉的质量安全水平。噬菌体fmb-p 1联合乳酸链球菌素和山梨酸钾对冷鲜肉中沙门氏菌的杀菌结果表明,噬菌体可以显著降低冷鲜肉中的沙门氏菌至检测限以下,约2-3 log CFU/g,而乳酸链球菌素和山梨酸钾对冷鲜肉中的沙门氏菌无显著影响。噬菌体联用乳酸链球菌素和山梨酸钾可以显著降低冷鲜肉中的菌落总数(2 log CFU/g ),抑制冷鲜肉的氧化,保持冷鲜肉的感官和质量品质,延长冷鲜肉货架期至14d。噬菌体处理对冷鲜肉的感官品质无不良影响。噬菌体在冷鲜肉中能够保持数量稳定,不会受到乳酸链球菌素和山梨酸钾的影响。因此,上述结果表明,噬菌体fmb-p1在冷藏食品致病菌的控制中具有巨大的应用潜力。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TS201.3

【相似文献】

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 汪昌保;沙门氏菌噬菌体fmb-p1生物学特性与噬菌机制及其在冷藏食品中的应用研究[D];南京农业大学;2016年

2 黄广涛;噬菌体在烧伤泛耐药细菌感染治疗中的应用研究[D];第三军医大学;2017年

，

本文编号：1280354