核质转运受体AtImportin α作为转录抑制因子调控茉莉酸信号的分子机理

发布时间：2017-12-15 04:32

  本文关键词：核质转运受体AtImportin α作为转录抑制因子调控茉莉酸信号的分子机理

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【摘要】：在真核细胞中,双层的核膜系统将细胞遗传信息的存贮、转录与蛋白质的翻译以及众多细胞的代谢过程分隔开来。而细胞核与细胞质之间的信息交流在细胞生命活动的调控过程中至关重要。镶嵌在核膜上的核孔复合体为两者之间的交流提供了一条双向的、选择透性的分子通道。金属离子、代谢产物以及小分子量的中性蛋白以自由扩散的形式进出细胞核,而分子量超过40KDa的大分子物质则需要与核质转运受体相结合以主动扩散的形式通过核孔进出细胞核。大多数的主动转运过程主要由两类在进化上相对保守的转运受体家族Importin(IMP)α和IMPβ所介导。在经典的核输入路径中,IMPα负责识别带有核定位信号的底物蛋白,然后与IMPβ结合形成三聚体复合物,进而启动转运过程。IMPα作为核质转运的接头蛋白,它的功能在动物和真菌中已经有了大量的研究和报道,但在植物中的进展却非常缓慢。到目前为止,植物IMPα直接参与的细胞信号转导及发育过程报道很少。本研究发现拟南芥的IMPα1、IMPα2和IMPα3可以不依赖自身的转运功能,而是作为转录抑制因子参与植物激素茉莉酸(jasmonate,JA)信号的调控过程。主要的研究结果如下:(1)IMPα1、IMPα2和IMPα3冗余地参与到负调茉莉酸诱导的花青素合成过程。通过对impα1、impα2和impα3各种单突变体,双突变体以及三突变的表型鉴定,我们发现与野生型相比,茉莉酸诱导的花青素积累量在impα1impα2impα3三突变体中明显增加,三突变体中受茉莉酸调控的与花青素合成相关基因的表达量也明显上调。而对于蔗糖和细胞分裂素(6-BA)诱导的花青素合成过程在三突变体中却没有受到影响,表明IMPα专一地调控茉莉酸诱导的花青素积累。(2)impα1impα2impα3三突变体对茉莉酸介导的系统性机械损伤响应显著增强。对系统性机械损伤响应过程的分析发现,野生型的损伤响应随处理时间逐渐上升,在2小时左右达到峰值,然后逐渐降低到原始水平。三突变体在受到损伤后,响应过程急剧上升并在1小时达到最高点,响应强度和速度均要快于野生型。这些结果说明与野生型相比,三突变体对茉莉酸信号更加敏感。(3)IMPα1、IMPα2和IMPα3与MYC2直接互作。利用酵母双杂交实验,发现茉莉酸信号的关键转录因子MYC2可以与IMPα1、IMPα2和IMPα3互作,但不与IMPα9互作。与MYC2同源关系非常近的两个转录因子MYC3和MYC4却不能与IMPα1、IMPα2和IMPα3互作。另外,利用双分子荧光互补试验我们可以在细胞核中检测到IMPα2与MYC22互作信号。而且MYC2在三突变体中仍然定位在细胞核内。表明IMPα1、IMPα2和IMPα3与MYC2特异性互作。通过缺失分析,我们发现MYC2的两个关键的结构域JAZ Interacting Domain(JID)和b HLH motif均可以与IMPα1、IMPα2和IMPα3结合。通过免疫共沉淀,我们发现MYC2(MYC2NT1-364)可以与IMPα2在体内互作,说明两者的结合并不依赖MYC2的核定位信号(KRPKKRGRK433-441)。而且IMPα2的缺失片段IMPα296-535不能与空载体上的核定位信号互作,却能与MYC2以及它的缺失突变互作,进一步证明了两者的互作与IMPα的转运功能无关。(4)IMPα1、IMPα2和IMPα3与WD-Repeat/b HLH/MYB复合体中的MYB型转录因子互作。利用酵母双杂交实验,我们发现IMPα1、IMPα2和IMPα3与MYB75以及MYB90有较强的互作活性。而且细胞核中也可以检测到IMPα2-MYB75的互作信号。另外,缺失分析发现MYB75的N端和C端也都可以与IMPα1、IMPα2和IMPα3结合。而且,JAZ-MYB75的互作也被IMPα1、IMPα2和IMPα3所阻断。这些结果进一步说明,IMPα1、IMPα2和IMPα3在与MYB75以及MYB90的互作中也不依赖于自身的转运功能。(5)IMPα1、IMPα2和IMPα3抑制了MYC2和MYB75的转录活性。MYC2作为转录激活因子,可以显著的激活靶启动子PTAT1和PVSP1驱动的LUC基因的表达,而MED25和抑制因子JAZ9可以分别增强或抑制MYC2的转录活性。IMPα1、IMPα2和IMPα3与MYC2共表达,不同程度地抑制了MYC2的转录活性。进一步分析显示,IMPα296-535同样能抑制MYC2激活的PTAT1-LUC和PVSP1-LUC表达。MYB75作为花青素合成路径中关键的转录激活因子,共转化实验发现MYB75能强烈诱导靶启动子PDFR-LUC的表达,JAZ9抑制子可以有效地抑制MYB75的转录活性,而MED25对PDFR-LUC的表达没有影响。与IMPα对MYC2转录活性的影响相似,IMPα1、IMPα2、IMPα3和IMPα296-535与MYB75的共表达同样也有效地抑制了报告基因PDFR-LUC的表达。这些结果说明IMPα1、IMPα2和IMPα3与转录激活因子的结合抑制了它们的转录激活活性。(6)IMPα1、IMPα2和IMPα3抑制了转录因子MYC2和MYB75的DNA结合活性。通过酵母单杂交以及EMSA实验我们发现,IMPα1、IMPα2和IMPα3与MYC2和MYB75的结合分别抑制了MYC2与G-box元件的结合以及MYB75与PCE元件的结合。说明IMPα通过干扰转录因子与DNA元件的结合来影响MYC2和MYB75转录激活活性。(7)IMPα1、IMPα2和IMPα3干扰了MYC2-MED25和WD-Repeat/b HLH/MYB转录复合体的形成。通过酵母三杂交和Pull-down实验,我们发现辅激活因子MED25与MYC2的结合被IMPα1、IMPα2和IMPα3的结合完全阻断。同样,IMPα与MYB75的结合阻断了TT8与MYB75的互作。这些结果说明IMPα1、IMPα2和IMPα3还可以通过影响转录起始复合体的形成来抑制转录激活因子的活性。(8)IMPα1、IMPα2和IMPα3通过影响WD-Repeat/b HLH/MYB转录复合体来负调茉莉酸诱导的花青素合成过程。我们通过遗传杂交的方式,获得了ttg1-lmimpα1impα2impα3四突变体。结果显示,在茉莉酸处理条件下,三突变中花青素含量增加的现象在四突变体中完全消失了。而且四突变体中茉莉酸诱导的花青素合成相关基因的表达也与ttg1-lm一致。进一步说明三突变体对茉莉酸诱导花青素合成敏感的表型是通过WD-Repeat/b HLH/MYB转录复合体发挥作用的。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2

【参考文献】

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1 Karen S. Schumaker;;SAD2 in Arabidopsis Functions in Trichome Initiation through Mediating GL3 Function and Regulating GL1,TTG1 and GL2 Expression[J];Journal of Integrative Plant Biology;2008年07期

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本文编号：1290664